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1、专业 名称 药理学 学位申请人王广发 指导教师吴曙光教授 答辩委员会主席黄明教授 答辩委员会成员刘培庆教授 叶文才教授 赵树进教授 陈志良教授 论文评阅人徐钤教授 李晓辉教授 苏薇薇教授 20 1O 年5 月8E l 广州 机制 no n fJYlflll11lllI7lIlIf7lllfl0llll4IIf9fIf0llJ 博士学位论丈 京尼平对人脐静脉内皮细胞胞吐的抑 制作用及其分子机制 博士研究生：王广发 指导教师：吴曙光教授 摘要 血管内皮细胞位于血管内腔表面，是血管壁与血液之间的分界屏障细胞。 它不仅是生物学上的结构与功能屏障，还是高度活跃的代谢库，能合成多种血 管活性物质。血管内皮
2、细胞的损伤和功能异常与多种疾病的发生相关或为始动 环节，尤其在心脑血管性疾病发病过程中起到重要作用。在血管内皮细胞功能异 常和损伤发生过程中，血管内皮细胞胞吐是最早发生的反应。血管内皮细胞受 到炎症刺激时，它通过胞吐释放大量炎症性因子，诱导大量的白细胞、血小板 粘附到血管内皮表面，加剧组织炎症与血栓的形成。内皮细胞胞吐已经成为研 究血管功能异常和损伤发生机制的一个重要方面。 内皮细胞内贮存大量的颗粒，它们包含前炎症因子与前凝血因子，例如： P - 选择素( P - s e l e c t i n ) 、E 一选择素( E - s e l e c t i n ) 、血管内皮粘附分子- 1 ( V
3、 C A M - 1 ) 和血管假性血友病因子( v w F ) 等，这些分子与细胞粘附、炎症及止血紧密相关。 P 选择素介导中性粒细胞在活化内皮细胞上的滚动，尤其在炎症过程的早期( 数 分钟) 甚为重要，在炎症晚期同其他选择素分子协同发挥作用。P 选择素还参与 血小板和某些T 细胞亚群的沿血管壁的滚动的过程。E 一选择素主要介导白细胞 ( 中性粒细胞、单核细胞和C D 4 + 记忆性T 细胞) 在内皮细胞表面最初的滞留和滚 动，以及随后迁移到炎症的组织。血管内皮粘附分子一1 主要介导淋巴细胞、单 核细胞嗜酸细胞和内皮细胞的粘附。它特异地与白细胞( 除中性粒细胞外) 所产 生的整合素家族的粘附
4、因子V L A 一4 结合，介导细胞粘附和信号传递，在细胞分化、 摘要 炎症反应、动脉粥样硬化等多种疾病病理生理过程中发挥作用。血管假性血友 病因子介导血小板粘附与聚集，启动血栓形成，特异性地反映血管内皮细胞功 能的异常。许多促分泌剂都能刺激内皮细胞胞吐，例如：凝血酶，组胺，白三 烯，补体等。根据胞吐是由钙介导还是C A M P 介导，促分泌剂分为两类。目前 研究最广的是凝血酶，它是一种钙调促分泌剂，它通过活化钙调蛋白升高细胞 内钙离子浓度，导致快速的胞吐。凝血酶与位于内皮细胞表面的受体结合刺激 血管内皮细胞释放P - s e l e c t i n 、E - s e l e c t i n
5、和V C A M _ 1 ，这一系列反应不仅推动 凝血过程和血小板黏附，而且促进中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞在内皮下 聚集，进一步使内皮细胞活化，刺激内皮收缩、通透性增加、黏附分子表达增 加、白细胞滚动和穿透力加强。凝血酶刺激内皮细胞已经成为研究血管内皮损 伤机制的一个重要模型。 内皮细胞的每个运输小泡的胞吐都经历装载，出芽，移位，对接，诱发， 膜融合，及再循环这几个阶段。几套蛋白调节小泡的转运，包括R a b 家族成员， N 乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白( N S F ) ，可溶性的N S F 附着蛋白， S N A P 受体蛋白( S N A R E s ) ，S e c M u
6、n c 家族。N S F 是调节胞吐的重要分子。它是 由六个相同的亚基组成的六聚体，每个亚基的分子量约8 5 k D ，各含三个结构域， 分别命名为N 、D 1 、D 2 结构域。N S F 只有存二个结构域协同作用时才能最大 限度地发挥自己的功能，其中N 结构域主要与S N A R E 复合物结合，D l 的A T P 酶活性是N S F 的主要功能，D 2 主要参与多聚体的形成，球形的N 结构域环绕 于环的外侧基底部。一氧化氮主要通过巯基业硝基化N S F 的D 1 结构域的C 2 6 4 位的半胱氨酸残基，阻止N S F 与S N A R E s 的解离，从而阻止胞吐。因此增加一 氧化氮
7、的产生就可抑制内皮细胞的胞吐，从而抑制细胞粘附，减缓血管炎症与 血栓形成在内皮细胞。在内皮细胞，一氧化氮主要由内皮型一氧化氮合酶催化 精氨酸合成一氧化氮。内皮型一氧化氮合酶的活化主要由磷脂酰肌醇3 激酶丝 氨酸苏氨酸蛋白激酶A k t ( P 1 3 K A k t ) 信号通路调控。磷脂酰肌醇3 激酶被激活 后，在细胞膜上生成第二信使磷脂酰肌醇4 ，5 二磷酸( P I P a ) ，P I P a 与细胞内 含有P H 结构域的信号蛋白A k t 和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶结合，促使磷酸肌醇 博士学位论文 依赖性蛋白激酶磷酸化A k t 蛋白的S e r 3 0 8 导致A k t 的活化，
8、A k t 激活内皮型一 氧化氮合酶，导致N O 的产生。此外，内皮细胞粘附性增加，血管炎症发生也与 炎症因子诱导的粘附分子大量表达密切相关。核因子k a p p aB ( N F - KB ) 信号通 路调控许多粘附分子的表达。粘附分子V C A M _ 1 和E s e l e c t i n 基因的启动子区 域存在N F - KB 的结合位点。N F KB 是一种普遍存在于各种细胞中的核转录因 子。N F _ KB 由两类亚基形成同源或异源二聚体。一类亚基包括p 6 5 ( 也称R e l A ) 、 R e l B 和C - R e l ；另一类亚基包括p 5 0 和p 5 2 。最常
9、见的N F KB 亚基组成形式为 p 6 5 p 5 0 或p 6 5 p 6 5 。在正常状态下，N F KB 在胞质中与它的抑制因子一KB ( IKB ) 结合在一起，失去转录活性。在炎症因子如凝血酶激活存在的情况下，IKB a 会在S e r 3 2 和S e r 3 6 被磷酸化，随后被泛素一蛋白酶体途径降解。N F - KB 和 IKB Q 解聚后，其核定位序列被暴露，从而被转运到细胞核内，在核内与目的 基因的启动子区域结合，促进N F - KB 依赖的基因转录。 京尼平是桅子果实中的主要成分之一栀子苷在肠和肝中的水解产物，是栀子 苷的苷元。栀子是我国的一种传统中药，具有泻火除烦，清
10、热利尿，凉血散瘀的 功效，被用于治疗热病心烦、火毒疮疡、外治扭挫伤痛、消渴目赤等症，在中医 处方中应用甚广。栀子含有多种化学成分，药理实验表明，以栀子苷为代表的烯 醚萜类成分为栀子的主要活性成分，它具有利胆、镇痛、保肝、抗癌、抗炎等 作用。近年来研究发现栀子苷在体内的主要活性产物是京尼平。京尼下具有明 显的抗炎与抗血栓作用。但作用机制尚刁清楚，然而内皮细胞胞吐与抗炎和抗 血栓有着密切的联系，提示我们京尼平可能具有抑制内皮细胞胞吐作用。 基于上述背景我们确定研究京尼平对人脐带静脉内皮细胞( h u m a nu m b i l i c a l v e i ne n d o t h e l a i
11、 lc e l l ，H U V E C ) 胞吐的作用及其机制。我们首先观察京尼半对内皮 细胞的增殖作用，以确定下一步实验京尼平的合适剂量，用于研究京尼甲对凝 血酶诱导的人脐静脉内皮细胞胞吐的抑制作用。然后存细胞水平研究京尼平对 凝血酶诱导的人脐静脉内皮细细胞与单核细胞的粘附抑制作用，以及在动物整 体水平研究京尼平对小鼠尾静脉出血时间的影响。最后从一氧化氮的产生，磷 I I I 摘要 脂酰肌醇3 激酶丝氨酸苏氨酸蛋白激酶A k t ( P 1 3 K A k t ) 信号通路和核因子 - k a p p aB 信号通路的作用来研究京尼平抑制胞吐的分子机制。 研究主要方法和结果如下： 一、0
12、5 - - - 1 6l x g m l 京尼平不影响人脐静脉内皮细胞的增殖 从新鲜胎盘分离出脐带，然后提取人脐静脉内皮细胞原代培养，采用C e l l c o u n t i n gk i t 一8 法评价O 5 、1 、4 、8 、1 6g g m l 的京尼平处理内皮细胞1 2 、2 4 和 4 8h 后的细胞增殖的影响。S P S S1 3 0 统计软件分析表明0 5 、l 、4 、8 、1 6g g m l 的京尼平处理内皮细胞1 2 、2 4 和4 8h 不影响人脐静脉内皮细胞的增殖。 二、京尼平抑制凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞胞吐 培养在6 孔板中的人脐静脉内皮细胞经不同浓度的京
13、尼平预处理各自不同时 间后，再用1 U m l 的凝血酶处理3 0 分钟，释放到人脐静脉内皮细胞培养液中人 V W F 采用酶联免疫吸附方法( E L I S A ) 测定；培养在2 4 孔板中的人脐静脉内皮细 胞经不同浓度的京尼平预处理各自刁i 同时间后，再用1 U m 1 的凝血酶处理3 0 分 钟。释放到人脐静脉内皮细胞表面的P s e l e c t i n 、E s e l e c t i n 和V C A M 1 采用表面 E L I S A 检测。结果表明1 1 6l a g m l 剂量范围内京尼平明显抑制凝血酶诱导的人 脐静脉内皮细胞对V W F 、P s e l e c t
14、 i n 、E s e l e c t i n 和V C A M 1 的胞吐，抑制作用 呈剂量依赖性。抑制作用在京尼平预处理1 小时后出现，并呈现明显的时间依 赖性。 三、京尼平抑制凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞粘附分子m R N A 和蛋白表达 前面结果表明京尼平抑制凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞对内皮细胞粘附 分子的胞吐，京尼平是否影响凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞粘附分子m R N A 和蛋白表达，接下来我们采用实时定量荧光P C R 技术和W e s t e r nb l o t 技术来验 证。不同浓度的京尼平预处理人脐静脉内皮细胞1 小时，然后用凝血酶刺激3 0 分钟，接着检测内皮细胞V
15、C A M 1 、E s e l e c t i nm R N A 和蛋白表达。结果表明，4 博士学位论文 1 6I t g m l 剂量范围内京尼平明显抑制凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞V C A M l 、 E s e l e c t i nm R N A 和蛋白的表达，抑制作用呈剂量依赖性。 四、京尼平抑制凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞与单核细胞粘附 前面实验表明京尼平明显抑制凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞对粘附分子的 胞吐和粘附分子m R N A 表达。在炎症性因子的刺激下，内皮细胞释放大量粘附 分子，导致白细胞包括中性粒细胞、单核细胞粘附到内皮表面，进一步加剧炎 症与凝血。京尼平是否能从功
16、能上抑制凝血酶诱导的内皮细胞与单核细胞的粘 附? 因此我们从细胞水平来研究京尼平对人脐静脉内皮细胞与单核细胞粘附的 影响。我们采用B C E C F A M 荧光探针装载人单核白血病细胞系T H P l 细胞，然后 将装载了荧光探针T H P - 1 细胞加入到依次用京尼平、凝血酶处理过的H U V E C s 细 胞培养孔共孵育。由于凝血酶的刺激，H U V E C s 释放大量粘附分子，导致贴壁生 长的H U V E C s 粘附大量荧光标记的人单核白血病细胞系T H P - 1 细胞，未粘附的细 胞用P B S 洗去，荧光显微镜下可观察到粘附在H U V E C s 上的单核白血病细胞系 T H P - 1 细胞，裂解细胞后用荧光分光光度计检测荧光强度。比较凝血酶处理组与 对照组；比较京尼平处理组与凝血酶处理组荧光强度，考察京尼甲对凝血酶诱 导的人脐静脉内皮细胞与单核细胞粘附的抑制作用。荧光显微镜下观察发现， 对照组：少量T H P
