苏州大学 硕士学位论文 可逆交联、温度敏感的聚合物囊泡用于蛋白质的可控释放 姓名：徐海飞 申请学位级别：硕士 专业：高分子化学与物理 指导教师：孟凤华 20100501 可逆交联、温度敏感的聚合物囊泡用于蛋白质的可控释放中文摘要 中文摘要 聚合物囊泡载体体系在生物医学和药物控释领域的应用已经引起科学家们的 广泛的关注本论文中，作者主要设计合成了一系列结构明确的，三嵌段聚合物 P E G - - P A A - P N I P A M ，研究了其囊泡的温度敏感性和可逆交联，并探索了该可逆交 联的温度敏感的聚合物囊泡用于蛋白质药物的细胞内释放 ( 1 ) 以大分子P E G - - D M P 作为链引发剂，通过序贯可逆加成撕裂链转移自由 基聚合方法得到具有温度敏感的聚乙二醇而景丙烯酸匆景埘异丙基丙烯酰胺三 嵌段聚合物( P E G 抛A 书N m ～M ) 嵌段聚合物中聚乙二醇的分子量为5 0 0 0D a 、 聚丙烯酸分子量为3 5 0 - 1 4 5 0D a 、聚丙烯酰胺分子量为1 1 0 0 0 —3 9 0 0 0D a 该嵌段 共聚物在室温下易溶于水，当水溶液升温到3 7 0 C 以上，溶液能迅速自组装形成纳 米囊泡( 粒径大约2 2 0r i m ) 。
通过共聚焦光散射激光显微镜( C S L M ) 和静态激光 光散射( S L s ) 方法证实了其囊泡结构囊泡的粒径大小和粒径分布取决于聚合物 浓度、聚丙烯酰胺的分子量、溶液平衡时间和晃动程度有趣的是，用含有二硫 键的胱胺以碳二亚胺化学法对囊泡进行化学交联，可以得到界面交联的囊泡通 过稀释、加入有机溶剂、改变盐浓度和改变溶液温度的方法，证实了交联后囊泡 的稳定性可以显著增加而在模拟细胞内的还原环境时，交联会因胱胺的二硫键 断裂而快速降解，聚合物囊泡溶解v r r c - 葡聚糖作为模拟蛋白质，能被高效地包 裹到囊泡内通过体外释放研究，即使温度降到L C S T 以下( 如2 矿C ) ，大部分 F 1 1 r C ．葡聚糖仍保留在交联的囊泡内但是，在加入1 0m M 的二硫苏糖醇时，大部 分v x r c - 葡聚糖从已解除交联的囊泡中释放出来这些可逆交联温度敏感的囊泡也 许可以作为智能型载体，应用于生物药剂的细胞内刺激释放，例如有效控释p D N A ， s i R N A ，蛋白质药物 ( 2 ) 三嵌段聚合物P E G - P A A - P N I P A M 的L C S T 受嵌段的比例、盐浓度、溶 液p H 的影响，可在2 8 0 C 至5 0 0 C 之间调节。
通过设计合适的嵌段比例，使嵌段聚 合物的L C S T 在P B S 中可从3 8 0 C 至4 3 0 C 之间，目的是使上述聚合物囊泡能在解 交联后在体温下溶解，从而释放出其包裹的药物为此设计得到了 P E G l l 3 - P A A 9 - P N I P A M l 0 7 ．P E G l l 3 - P A A 2 4 - - P N I A P M l 9 3 ，和P E G l l 3 - P A A 3 5 " - P N I P A M 2 9 0 它们的L C S T 均在3 8 - 4 2 0 C 之间F I T C - B S A 作为模拟蛋白质，能被高效地包裹到 中文摘要 可逆交联、温度敏感的聚合物囊泡用于蛋白质的可控释放 该囊泡内该界面交联的温度敏感的聚合物囊泡对其他研究的蛋白质( 如细胞色 素C ，溶菌酶，卵清白蛋白和免疫球蛋白) 的包裹效率略低，但也在3 5 - 5 0 ％，载 药率为4 - 5 0 w t ．％通过体外释放研究( 3 7 0 C ) ，在加入1 0m M 的二硫苏糖醇时，大 部分蛋白质( 8 0 ％) 从交联的囊泡中释放出来。
而没有加入1 0m M 二硫苏糖醇时， 大部分蛋白质( 8 0 一8 5 ％) 在8 小时后能仍保留在囊泡内体外细胞实验结果说明， 这种蛋白质载体能有效将蛋白质运输到细胞内所以，这些可逆交联温度敏感的 囊泡可能克服现有技术的缺陷，提高囊泡对小分子药物、大分子药物以及探针分 子的包载效率，提高囊泡在体内血液中循环的稳定性，提高囊泡被肿瘤细胞内吞 的效率，从而提高药物的生物利用度 关键字：囊泡；可逆交联；温度敏感；药物和蛋白质释放 Ⅱ 作者：徐海飞 指导老师：孟风华副教授 R e v e r s i b l yc r o s s l i n k e dt e m p e r a t u r e - r e s p o n s i v en a n o - s i z c dp o l y m e r s o m e sf o re f f i c i e n tp r o t e i nd e l i v e r y A b s t r a c t R e v e r s i b l yc r o s s l i n k e dt e m p e r a t u r e - r e s p o n s i v en a n o - s i z e d p o l y m e r s o m e sf o re f f i c i e n tp r o t e i nd e l i v e r y A b s t r a c t P o l y m e r s o m e sh a v ea t t r a c t e ds i g n i f i c a n ta t t e n t i o n sf o rb i o m e d i c a la p p l i c a t i o n sa n d d r u gd e l i v e r ys y s t e m s ．I nt h i st h e s i s ，w eh a v es y n t h e s i z e d as e r i e so fw e l ld e f i n e db l o c k c o p o l y m e r o fP E G - P A A - - P N I P A M ，s t u d i e dt h e i rt h e r m a l s e n s i t i v i t yd u r i n g t h e f o r m a t i o no ft h ep o l y m e r s o m e sa n dt h er e v e r s i b l ec r o s s l i n k i n g ，a n d e x p l o r e dt h e e n c a p s u l a t i o no ft h ep r o t e i n si n t ot h ep o l y m e r s o m e sa n dt h ei n t r a c e l l u l a rr e l e a s eo ft h e p r o t e i n s ． ( 1 ) W a t e r - s o l u b l et e m p e r a t u r er e s p o n s i v e t r i b l o c k c o p o l y m e r s ，p o l y ( e t h y l e n e o x i d e ) - - b - p o l y ( a c r y l i ca c i d ) - - b - - p o l y ㈣s o p r o p y l a c r y l a m i d e ) ( P E O - - P A A - P N I P A M ) ，w e r e p r e p a r e di no n ep o tb ys e q u e n t i a lr e v e r s i b l ea d d i t i o n - f r a g m e n t a t i o n c h a i n - t r a n s f e r ( R A F T ) p o l y m e r i z a t i o nu s i n g a P E O - t r i t h i o c a r b o n a t e ( P E O - S 一1 - d o d e c y l 墨_ ( 冠尺一 d i m e t h y l - R - a c e t i c a c i d ) t r i t h i o c a r b o n a t e ) a sam a c r oc h a i nt r a n s f e ra g e n t ．T h eb l o c k c o p o l y m e r sh a v e 眠P E Oo f5k D a ，％P A Ao f0 ．3 5 —1 ．4 5k D a ，a n d ％P N I P A Mv a r y i n g f r o m11 - 3 9k D a ．T h e yw e r ef r e e l ys o l u b l ei nw a t e ra su n i m e r sa tr o o mt e m p e r a t u r e ，b u t q u i c k l ys e l f - a s s e m b l e di n t on a n o - s i z e dv e s i c l e s ( a b o u t2 2 0n m ) w h e nr a i s i n gt h e s o l u t i o nt e m p e r a t u r et o3 7o C ．T h ev e s i c u l a rs t r u c t u r ew a sc o n f n - r n e db yc o n f o c a l s c a n n i n gl a s e rm i c r o s c o p e ( C S L M ) a n ds t a t i cl i g h ts c a t t e r i n g ( S L S ) m e a s u r e m e n t s ．T h e s i z ea n ds i z ed i s t r i b u t i o no ft h ep o l y m e r s o m e sd e p e n d e do ns o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n , m o l e c u l a rw e i g h to fP N I P A M ，t h ee q u i l i b r i u mt i m ea n ds h a k i n g ．I n t e r e s t i n g l y ，t h u s f o r m e dv e s i c l e sc o u l db er e a d i l yc r o s s q i n k e da tt h ei n t e r f a c eu s i n gc y s t e a m i n ev i at h e c a r b o d i i m i d ec h e m i s t r y ．T h ec r o s s l i n k e dp o l y m e r s o m e s ，w h i l es h o w e dr e m a r k a b l e s t a b i l i t ya g a i n s td i l u t i o n ，o r g a n i cs o l v e n t ，h J } g h s a l tc o n d i t i o n sa n d c h a n g e o f t e m p e r a t u r ei nw a t e r ，w e r eo t h e r w i s er a p。
