植物基因转化与转基因植株鉴定

植物基因转化与转基因植株鉴定植物基因转化与转基因植株鉴定 一、相关背景知识一、相关背景知识和实验原理和实验原理 （一）相关背景知识链接（一）相关背景知识链接 应用 DNA 重组技术构建植物表达载体，通过农杆菌转化双子叶植是目前比 较常用的植物转化方法利用表达载体上的筛选标记在转化植株培养时进行筛 选同时，目标基因与 GUS 基因共同转化，在转化植株通过 GUS 染色，能够鉴 定出转基因植株整个实验过程大约一个月左右可以鉴别出转化苗 （二）实验原理（二）实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化 性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根根癌农杆 菌和发根农杆菌中细胞中分别含有 Ti 质粒和 Ri 质粒，其上有一段 T-DNA，农 杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA 插入到植物基因组中因此， 农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系 通过基因克隆与重组技术将目的基因插 入到经过改造的 T-DNA 区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移 与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株图 1 图 1 外源基因转化流程图 三、实验目的和实验要求三、实验目的和实验要求 目的： 学习和掌握从基因分离克隆到植株转化及转基因植株的筛选整个实验 体系。

要求： 综合利用前面的单个实验环节所掌握的知识， 获得完整的实验理念， 并在实验过程中学会设计、构建适合的载体并将外源基因转化植株 四、实验材料和方法四、实验材料和方法 （一）实验仪器（一）实验仪器 PCR 仪， 凝胶成像系统， 台式高速离心机， 台式高速冷冻离心机， DU 640 紫 外分光光度计，UV-2450 分光光度计，精密 pH 计，微量移液器，控温摇床，电 子天平，制冰机，-80C 超低温冰箱，电热恒温水浴锅，自动电热压力蒸汽灭菌 器，超净工作台，光照培养箱等 （二）（二）试剂及配方试剂及配方 Trizol试剂，RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit，DNase I，2 PCR Master Mix，FastDigest 限制性内切酶，T4 DNA Ligase，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶， pEASY-Blunt C， 质粒提取试剂盒 （E.Z.N.A. Gel Extraction Kit） ， 凝胶回收试剂盒 （E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I） ， DNA提取试剂盒， Kanamycin （Kan） ，Ampicillin（Amp） ，Carbenicillin（Cb） ，电泳缓冲液，LB培养基、YEB 培养基，烟草培养基如下表1. 表 1 烟草培养基表（单位:mg/L） Table 1 List of tobacco plants culture media (mg/L) 培养基类型 基本培养基 6-BA IAA Kan Cb 种子萌发培养基 MS - - - - 分化培养基 MS 3 0.1 - - 生根培养基 MS - 0.5 - - 选择分化培养基 MS 3 0.1 50 400 选择生根培养基 MS - 0.5 100 400 （三）实验步骤（三）实验步骤 1. 引物设计 采用 Oligo 7 对玉米 ZmMKK4 序列（GenBank 序列号：GU942956.1）进行 引物设计，引物设计原则及方法见（第五章实验二十四核酸序列分析和引物设 计） 。

为了便于酶切，我们在分别在上游引物 5’端加上 BamHⅠ酶切位点（下划 线部分）保护碱基，下游引物 5端加上 SalⅠ酶切位点（下划线部分）和保护碱 基，得到如下序列： 上游引物 F-ZmMKK4：5- GCGGGATCCATGAGGCCGGGCGGGCC -3 下游引物 R-ZmMKK4：5-GCGGTCGACGGATTTCGGCGAGCCATCATGAC -3’ 2. RNA 提取及反转录成 cDNA （1）玉米总 RNA 的提取 玉米总 RNA 的提取采用 Trizol（Invitrogen）试剂法，具体操作如下： 1) 取 2g～～5g 新鲜玉米叶片液氮中充分研磨后加入到 1ml 的 Trizol 中，涡旋 5min～～10min 2) 放置 5min，在低温冷冻离心机中 12000g，4C 离心 10min 3) 将上清液转移至另一个新的干净的 2ml 离心管中，加入 200μL 氯仿，轻 轻摇动均匀，常温放置 5min 4) 4C，<12000g 离心 15min 5) 小心的将上层水相转移至新的离心管后，加入 0.5mL 异丙醇，轻轻混匀 后常温放置 10min。

4C，<12000g 离心 10min. 6) 去掉上清液，用 75%乙醇（无水乙醇：DEPC 水=3：1）洗涤4C，<7500 g 离心 5min 7) 去掉上清液，并在干燥空气中晾干（约 5min～～10min） 8) 根据沉淀的量加入 30μL～～50μL 的 RNase-free 水，55C～～60C 处理 10min 溶解 9) 分光光度计测定提取的总RNA光密度值， 冰上保存进行后续实验或-80C 保存 （2）cDNA 合成 1） 在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物 1μg～～5 μg RNA 1 μLOligo(dT)15 或 Random primer， 补 RNase-free ddH2O 至 12.4 μL； 2） 进行变性退火反应 70C，5 min, 短时离心后冰浴 5 min； 3） 在上述离心管中配制反转录反应液 4 μL 5 first-strand buffer, 1 μL dNTPs （10mM each） , 0.6 μL RNase Inhibitor, 1 μL M-MLV ； 4） 按下列条件进行反转录反应 42C，60 min（随机引物为 37C，60min） ； 5） 终止反应 70C，5 min 终止反应，置冰上进行后续实验或-20C 保存。

3. 目标基因 PCR 扩增 采用 PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶从玉米 cDNA 中扩增 ZmMKK4 全长编码序列（GenBank 序列号：NM_001158890.1） ZmMKK4 扩增引物：F-ZmMKK4，R-ZmMKK4 25μL 反应体系为：5 μL 5 PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus)，2 μL dNTP Mixture (各 2.5 mM)，1μL 上游引物（5μM），1μL 下游引物（5μM），1 μL cDNA，0.25 μL PrimeSTARTM HS DNA Polymerase，加 ddH20 至 25μLPCR 扩增程序为 98C 1～3 min 98C 10 s 58C 15 s 72C 1.5 min 72C 10 min 4. PCR 产物凝胶电泳回收 电泳回收采用 E.Z.N.A 胶回收试剂盒（OMEGA）试剂盒，操作按照试剂盒 说明书进行 35 个循环 （1）将 PCR 产物点样于琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，切下含目的 片段条带的凝胶，并尽可能少的含有凝胶。

（2）称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在 1.5mL 离心管中并 称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积一般情况下，凝胶的密度为 1g/mL， 于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算： 凝胶薄片的重量为 0.2g 则 其体积为 0.2mL；加入等倍凝胶体积的 Binding Buffer （3）50C～～60C 水浴加热约 10min 至胶全融，（每隔 2min～～3min 轻轻颠 倒离心管以混匀，以加速凝胶溶解），呈淡黄色透明液体 （4）等凝胶完全溶解，转移 700μL 的 DNA-琼脂糖溶液到一个 HiBindTM DNA 柱子，并把柱子装在一个干凈的 2mL 收集管内，室温下，10000g 离心 1min，弃去液体 （5） 将柱子重新套回收集管中， 加 300μL Binding Buffer 至 HiBind DNA 柱 子中；室温下，10000g 离心 1 分钟，去弃滤出液；这一步相当关键，不要忽 略此步 （6） 将柱子重新套回收集管中， 加入700μL SPW Wash buffer至HiBind DNA 柱子中，室温下，10000g 离心 1 分钟，去弃滤出液。

注：SPW Wash buffer 在使用前必须按瓶子标鉴要求用无水乙醇进行稀释 （7） 将柱子重新套回收集管中， 重复加入 700μL SPW Wash buffer 至 HiBind DNA 柱子中，室温下，10000g 离心 1 分钟，去弃滤出液； （8）弃去液体，将空柱子重新套回收集管中，10000g 离心 1min 以甩干 柱基质残余的液体 注：这步可以去除柱子基质上残余的乙醇，不要省略此步-----对得到好的 DNA 产量是十分重要的 （9）把柱子装在一个干凈的 1.5mL 离心管上，加入 30μL~50μL 洗脱液或灭 菌水上柱子膜上， 10000g 离心 1 分钟， 离心管中的溶液就是纯化的 DNA 产物， 保存于-20C 5. 目标片段与克隆载体的连接反应 目的片段回收后，连接到 pEASY-Blunt Cloning Vector（北京全式金生物技 术有限公司）连接操作采用载体配套操作说明书： 连接反应体系：PCR 产物 0.5μL～～4 μL，pEASY- Blunt Cloning Vector 1μL，轻 轻混合，室温 (20C～～37C) 反应 5min。

反应结束后，将离心管置于冰上反 应结束后，连接产物转化感受态细胞 6. 连接产物转化感受态细胞 (1) 加连接产物于 50 μLTrans1-T1（载体配套感受态），在感受态细胞刚刚 解冻时加入连接产物，轻弹混匀，冰浴 20min～～30min (2) 42C 热激 30s，立即置于冰上 2min (3) 加 1mL 常温 LB 液体培养基，150 rpm，37C 孵育 1h (4) 室温，3000rpm 离心 5min，去掉 900μL 上清液，将沉淀重新悬浮，均匀 地涂布于 LB 固体抗性培养基上，倒置于 37C 培养箱培养过夜 7. 阳性转化子的鉴定 （1）阳性转化子的快速筛选 做菌落 PCR，用无菌牙签在 37C 培养过夜的平板上长出的单菌落表面沾 取少量菌体接种到PCR反应体系中， PCR体系及引物参见步骤3目标基因PCR 扩增 扩增产物经凝胶电泳分析 如含有目的片段的单菌落则鉴定为阳性菌落 （2）阳性质粒的提取 经 PCR 快速筛选鉴定为阳性的单菌落接入含卡那霉素的 LB 液体培养基 中，37C，250rpm 过夜培养 质粒提取采用质粒提取试剂盒（E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I）提取，提 取方法采用试剂盒说明书。

具体步骤为： 1） 用干净的 1.5ml 的离心管收集过夜培养的菌液，室温下 10000g 离心 1min，视菌液浓度可多次收集到足够细胞弃去上清液 2）加入 250 μL 的 Solution I，用振荡器振荡混匀 3） 加入 250 μL 的 Solution II， 轻柔旋转离心管混匀 室温放置 2min～～3min 4）加入 350 μL 的 Solution III，立即上下颠倒离心管混匀 5）室温下，130。