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1、分类号： Q966 单位代码： 10335 密 级： 学 号： 10716018 博博 士士 学学 位位 论论 文文 黑翅土白蚁体内纤维素酶编码基因的克隆与表达黑翅土白蚁体内纤维素酶编码基因的克隆与表达 Cloning and expression of endogenous cellulase genes from Odontotermes formosanus (Isoptera: Termitidae) 作者姓名作者姓名 陈陈 春春 润润 指导教师指导教师 莫莫 建建 初初 教授教授 学科学科(专业专业) 环境生物学环境生物学 研究方向研究方向 城市昆虫学城市昆虫学 所在学院所在学院 农
2、业与生物技术学院农业与生物技术学院 论文提交日期论文提交日期 2010 年年 7 月月 黑翅土白蚁体内纤维素酶编码基因的克隆与表达黑翅土白蚁体内纤维素酶编码基因的克隆与表达 论文作者签名论文作者签名: 指导教师签名指导教师签名: 论文评阅人： 隐名评阅 答辩委员会主席：程家安 教授 浙江大学 委员 1：娄永根 教授 浙江大学 委员 2：祝增荣 研究员 浙江大学 委员 3：徐志宏 教授 浙江农林大学 委员 4：傅桂明 主任医师 浙江省疾病预防控制中心 委员 5：莫建初 教授 浙江大学 答辩日期： 2010 年 9 月 1 日 Cloning and expression of endogenou
3、s cellulase genes from Odontotermes formosanus (Isoptera: Termitidae) Authors signature: Supervisors signature: Examining Committee Chairperson: Prof. Jiaan Cheng Zhejiang University Examining Committee Members: Prof. Yonggen Lou Zhejiang University Prof. Zengrong Zhu Zhejiang University Prof. Zhiho
4、ng Xu Zhejiang A Bhat, 2000)。放线菌类主要有链霉菌属(Streptomyces)、高温放线菌 属(Thermoactinomycete)和弯曲热单孢菌(Theremomonospora curvata)等(魏亚琴和 李红玉, 2008)。目前研究较多的是真菌和细菌，对放线菌研究的相对较少。 1.1.3.2 产纤维素酶的动物 在自然界中除了微生物能降解纤维素以外，还存在着降解纤维素的动物，这 些动物主要包括食木性的节肢动物以及草食性动物，如白蚁、食木蟑螂、蜗牛、 线虫等。过去人们认为这些动物之所以取食纤维素，是因为其体内含有大量可以 水解纤维素的共生菌。依靠其消化道内
5、共生的这些微生物和原生动物，它们可以 完成对纤维素的消化。但是随着研究的深入，人们发现这些动物本身也能分泌纤 维素酶。1998年，Smant等用分子生物学的方法，从寄生植物的线虫体内得到了4 个线虫的内切-1,4-葡聚糖酶cDNA(Smant et al.,1998)。 同年， Watanabe等从白蚁 体内得到了白蚁的内切-1,4-葡聚糖酶cDNA，从而证明了动物体内确实存在内 源性的纤维素酶(Watanabe et al., 1998)。目前，许多动物的产酶基因已被找到， 这些动物包括恒春新白蚁(Neotermes koshunensis)、达尔文澳白蚁(Mastotermes darwi
6、niensis)、山林原白蚁(Hodotermopsis sjostedti)、黄胸散白蚁(Reticulitermes flaviceps)、栖北散白蚁(Reticulitermes speratus) 、台湾乳白蚁 (Coptotermes formosanus)、澳大利亚矛颚家白蚁(Coptotermes acinaciformis)、高山象白蚁 (Nasutitermes takasagoensis)、台湾华扭白蚁(Sinocapritermes mushae)、黑翅土白 蚁(Odontotermes formosanus)、美洲大蠊(Periplaneta americana)、食木
7、蟑螂 (Panesthia cribrata)、德国小蠊(Blattella germanica)、密刻隐尾蠊(Cryptocercus clevelandi)、意大利蜜蜂(Apis mellifera)、红螯龙虾(Cherax quadricarinatus)、紫海 胆(Strongylocentrotus purpuratus)、 安德爱胜蚓(Eisenia Andrei)、 福寿螺(Ampullaria crossean)、皱纹盘鲍(Haliotis discus)、异体住囊虫(Oikopleura dioica)和原虫 浙江大学博士学位论文 引言 4 (Pseudotrichonymp
8、ha grassii)等。 1.1.3.3 产纤维素酶的植物 纤维素酶广泛存在于植物中， 在植物发育的不同阶段发挥着水解细胞壁的作 用，如果实成熟、蒂柄脱落等过程。但是在植物中提取纤维素酶比较困难，且含 量不高。所以，现在人们主要研究的是微生物纤维素酶和动物内源性纤维素酶。 1.1.4 纤维素酶的应用 目前，纤维素酶的应用主要集中在微生物纤维素酶的应用上。纤维素酶已被 广泛应用于食品、酿酒、饲料加工、纺织、洗衣、农业等多个领域中。 1.1.4.1 食品工业中的应用 食品工业是纤维素酶应用最广泛的领域之一。 植物性副产品是食品加工业的 主要原料,其主要成分是纤维素、半纤维素及少量果胶等。利用纤维
9、素酶处理,可 使以上组分不同程度的得到降解,增加产品质量。 1.1.4.1.1 水果与蔬菜加工 在水果和蔬菜加工过程中采用纤维素酶进行适当处理， 可使植物细胞壁发生 不同程度的改变，从而改变细胞壁的通透性，提高细胞内含物(如蛋白质、淀粉、 油脂和糖等)的提取率，还可使植物组织软化膨润，提高可消化性和口感。例如， 用纤维素酶处理大豆，可促使其脱皮，增加从大豆或豆饼中提取优质水溶性蛋白 的效率，也可用于回收豆渣中的蛋白质和油脂。在制备脱水蔬菜如胡萝卜、土豆 等时，经适当纤维素酶处理后再干燥脱水，可改进脱水蔬菜的烧煮性和复原性。 另外，将纤维素酶合理的用于果蔬汁的生产，可促进果汁的提取和澄清，增加水
10、 溶性纤维的含量，使膳食纤维在果汁中的比例增加，提高果汁的产量(邵学良和 浙江大学博士学位论文 引言 5 刘志伟, 2009)。 1.1.4.1.2 酒类生产 纤维素酶应用于制酒工业,在进行酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精 和白酒的出酒率和原料的利用率、降低醪液的粘度、缩短发酵时间,若使用野生 植物的淀粉作为发酵工业原料,添加纤维素酶对原料利用率的提高更明显。在啤 酒酿造中，将纤维素酶应用于麦芽生产，可增加麦粒溶解性，加快发芽，减少糖 化液中-葡聚糖含量，改进过滤性能，适合于低质量大麦生产高质量啤酒。在葡 萄酒生产中， 添加纤维素酶有利于果皮浸解， 提高色素提取； 有利于澄清和过滤； 有利
11、于提高葡萄酒的质量和稳定性；提高葡萄酒的香味。在白酒酿造中，使用纤 维素酶对原料进行处理，不仅可以分解植物细胞壁释放淀粉，还能将部分纤维素 转化为糖，再经酵母分解全部转化为酒精，提高出酒率，而且酒体质量纯正。另 外， 利用纤维素酶结合糖化酶， 将酒糟中的残余淀粉和粗纤维降解后进行再利用， 可以提高出酒率，降低生产成本(姜淑荣, 2008)。 1.1.4.1.3 酱油酿造 酱油是大豆蛋白酶水解产物，是一种富有营养价值的调味品。酱油的生产过 程是一个复杂的生物反应过程，它是将无味的蛋白质、淀粉和脂肪原料，经制曲 和发酵，在微生物释放的各种酶的作用下，生成胨、氨基酸、糖份、甘油和有机 酸等呈味物质，
12、在经过后熟发酵，加上食盐组成具有酸、甜、咸、鲜、苦五味调 和的独特风味的调味品。 纤维素酶在酿造酱油中的作用之一是把原料中的纤维素 分解成葡萄糖， 被分解的葡萄糖在酱油酿造的发酵过程中可进行美拉德反应加深 酱油的色泽，同时还可以成为有益微生物的碳源。作用之二是使植物细胞壁的主 要成分纤维素一步步的分解，最后被溶解破坏，使得细胞内藏的蛋白质和淀粉充 分游离释放出来，从而提高酱油的出率。作用之三是协助米曲霉酶把淀粉分解成 糖类，在制曲发酵过程中从空气中落入的酵母和细菌利用这些糖类进行繁殖，并 分解出酒精和有机酸等。 纤维素酶也可以在水解底物产生适当的有机酸如乙酸或 浙江大学博士学位论文 引言 6
13、丙酸之类，增加酱油风味，提高酱油质量(史龙君, 2008)。 1.1.4.2 饲料工业中的应用 在饲料中添加纤维素酶可以破坏植物的细胞壁，使细胞内容物裸露出来，被 淀粉酶和蛋白酶进一步降解，有利于动物胃肠道的消化吸收，提高营养物质的吸 收和利用率；补充内源酶的不足，提高动物对粗纤维的利用率，同时还可以改善 消化道酶系组成、酶量及活性，并改善消化道环境，增加酸度，激活胃蛋白酶； 消除抗营养因子，降低消化道内容物的黏度，增加内源酶的扩散，增大酶与营养 物质的接触面积，提高营养物质的消化率；维持小肠绒毛形态的完整性，消化粗 蛋白和粗脂肪，促进小肠对营养物质吸收以及与细胞壁结合的矿物质的吸收，提 高机
14、体代谢水平，增加机体免疫力；降低有害微生物附着的可能性，还可促进有 益微生物生长，提高微生物对饲料的分解，同时增加单细胞蛋白含量。 在奶牛养殖上，纤维素酶能增强奶牛食欲，增加粗饲料的采食量，提高饲料 的消化率、利用率，提高产奶量，同时，还能降低奶牛消化道的发病率。在肉牛 的养殖上，纤维素酶可提高肉牛日增重，降低了料增重比，缩短了育肥周期，增 加经济效益。在肉鸡养殖上，添加纤维素酶可提高饲料消化率、蛋白质利用率、 能量利用率和代谢能值，提高肉鸡的增重，减少饲料消耗。在生猪养殖上，纤维 素酶可改善肠道环境，减少消化道疾病，促进仔猪生长，提高育肥猪的平均日增 重与饲料转化率，改善胴体品质。在水产养殖
15、上，添加纤维素酶能提高酚氧化酶 活性以及抗菌能力，促进鱼虾的生长，降低饵料系数，提高增重率(崔琰和寇叙, 2008)。 1.1.4.3 洗涤剂工业中的应用 当今社会生活中，人们越来越青睐棉纺织品，因为它具有良好的透气和吸水 性能。棉纤维的纤维素分子链由结晶区和非结晶区两部分组成，结晶区中的纤维 素分子结合状态规则且非常紧密，污垢等其他物质无法侵入。而非结晶区中的纤 维分子排列不规则、结合疏松，水很容易侵入(这正是棉纺织品透气、吸水性好 浙江大学博士学位论文 引言 7 的主要原因)，水以及污垢在非结晶区的入侵、结合，形成了凝胶状结构，使得 织物发黄、变硬，致使一般洗涤剂无法去除这些被封闭在凝胶结构中的污垢。 在洗涤剂中加入碱性纤维素酶可以直接作用于织物非结晶区，能有效的软 化、水解纤维素分子与水、污垢结合形成的凝胶结构，使封闭在凝胶结构中的污 垢较容易的从非结晶区分离出
