实验一：线粒体和细胞核的制备与观察.

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1、实验一 线粒体和细胞核的制备与观察 细胞内线粒体的超活染色与观察 细胞生物学实验 细胞生物学实验细胞生物学实验 实验目的 通过动物肝细胞核、线粒体的分离，了 解细胞器分离的一般原理和方法。 掌握用差速离心法分离动物细胞核及线 粒体的技术. 了解分级分离细胞核与线粒体的纯度检 测方法 学习线粒体活性染色技术, 观察活细胞内 线粒体的形态、数量与分布 实验原理 制备线粒体及细胞核采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。 悬浮介质通常采用一定pH的缓冲蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相， 在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性。 线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶,该酶能使脂溶性的詹纳斯绿B染料

2、保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还 原成无色. 线粒体能在詹纳斯绿B染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显 微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布； 詹纳斯绿B是一种是毒性较小的碱性染料，能对动植物的细胞或组织在活 体状态下进行无毒害的染色，其原理主要是碱性染料的胶粒表面带有阳 离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用 ，染料就被堆积下来。 细胞核DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性 ，很容易与带正电荷的碱性染料以离子或氢键结合而被染色，此外，由 于核蛋白中还有少量的弱酸性物质，因此，詹纳斯绿B也能被堆积下来而

3、使细胞核呈现蓝色。 细胞生物学实验细胞生物学实验 活体染色 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着 色但又无毒害的一种染色方法。 它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不 影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变 化以致引起细胞的死亡。 活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结 构和生理、病理状态。 活体染色 根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体 染色分为体内活染和体外活染两类。 体内活体染色：是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内， 染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于 识别的目的。 体外活体染色(超活染色)：它是由活的动、植物分离出部分 细胞或组织小块，以染料溶液

4、浸染，染料被选择固定在活细 胞的某种结构上而显色。 作为活体染色剂：对细胞无毒性或毒性极小的染料 ，而且总要配成稀淡的溶液来使用。 活体染料多为碱性染料,如中性红,詹纳斯绿B,次甲基蓝等 对某种细胞器的染色具有专一性,如中性红染液泡, Janus green B染线粒体。 细胞生物学实验细胞生物学实验 实验用品 实验材料 小白鼠肝脏 人口腔粘膜上皮细胞 细胞生物学实验细胞生物学实验 实验用品 实验试剂 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷 (Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4) 0.2%和0.02%詹纳斯绿B(Janus green B)染液 生理盐水 仪仪器、用具：显显

5、微镜镜，高速冷冻冻离心机,玻璃匀 浆浆器,解剖器具，剪刀，漏斗，尼龙龙网，刻度离心 管等 细胞生物学实验细胞生物学实验 实验内容 1.小鼠细胞器(细胞核,线粒体)的分离提取 2.分离提取物(细胞核,线粒体)鉴定 3.人口腔粘膜上皮细胞线粒体超活染色 1.细胞器(细胞核,线粒体)的分离提取 (1）获取肝脏：用颈椎脱臼法处死小鼠,置于解剖盘中剪开 腹腔,迅速取出小鼠肝,称重1克放入小烧杯内用吸管吸取 预冷的生理盐水洗净血液。 (2）匀浆：将鼠肝剪碎置于预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲液中 洗涤数次至鼠肝发白。然后置于玻璃匀浆器中，加入 10ml预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲液匀浆至肝组织基本碎裂

6、 (分次加入缓冲液)。（注：整过程在冰浴上进行） (3）过滤：双层尼龙布将匀浆液过滤到预冷的小烧杯中。 实验步骤 （4）细胞核与线粒体分离： 匀浆滤液 8mL，1000g离心10min 沉淀1（细胞核及碎片）涂片A上清液 1(涂片B,鉴定细胞核、线粒体) 重悬沉淀并洗涤1次 （8mL预冷的0.25mol/L蔗糖缓 冲液，1000g 离心10min） 沉淀2（细胞核及碎片 ） 涂片D 11000g离心10 min 沉淀3（线粒体） 涂片E 上清液 3 涂片F 上清液 2 （涂片C） 注意：沉淀与上清液从离心机取出后均要置于冰浴上 细胞生物学实验细胞生物学实验 取悬液1 滴，置载玻片一 端，取另一

7、边缘光滑的 载片，放在悬液滴前面 慢慢向另一端推动力移 ，保持推片与载片30 45角，液滴即沿推片散 开，注意用力平稳均匀 ，载片上便留下一层薄 膜。 涂片示意图 2.分离提取物(细胞核,线粒体)鉴定 将共6张涂片，不待干即滴加0.2%Janus greenB染色15 -20min后,盖上盖玻片，镜检 l线粒体呈蓝绿色,圆形、椭圆或短棒状颗粒。如 果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色絮状，难以辨 认。 l细胞核呈深蓝色。 l血细胞不着色。 注意：得到的沉淀物须加预冷0.25mol/L蔗糖缓冲液将 其悬浮后再装片，制线粒体装片时，悬浮液只需一小 滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。 实验步骤 细胞生

8、物学实验细胞生物学实验 实验步骤 3.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察 将载玻片(必须十分清洁)平放在桌面上，滴2滴0.02%詹纳斯 绿B染液于载玻片中央； 用消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取口腔上 皮细胞(粘液状物)，均匀地涂布在载玻片上的染液中，染 色5-15min (注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) ，盖上玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干； 低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜观察 。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中分布着一些被染成 蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体 。 细胞生物学实验细胞生物学实验 实验结果 图2：人口腔粘膜上皮细胞(示线粒体

9、) 图1：小鼠肝细胞核 在光学显微镜油镜下进行观察：功能 完整的线粒体呈现蓝绿色圆形或棒状 颗粒（绿色箭头所指） （注意：可见蓝绿色渐渐变淡现象， 蓝绿色强度显著减弱或呈现无色，表 明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不 全或功能丧失 ） 注：红色箭头所指为细胞核 细胞生物学实验细胞生物学实验 图3：在显微镜下观察到的鼠肝脏离体线粒体 细胞生物学实验细胞生物学实验 匀浆缓冲液预冷(4 ) 冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直揷入匀浆管中，上下转动研磨3- 5次，尽可能充分破碎细胞 (适度研磨)，缩短匀浆时间。 试验全过程要在04进行,离心机温度设为 4 整个分离过程不宜过长,要尽快。 离心机使用：离心管要平衡

10、g为离心力(RCF) RCF(g)=1.11810-5 r (rpm)2 r:有效半径(cm), rpm:转速(转/分) 注意事项 只有3台可用的冷冻离心机，每一次的离心时间较长，因此 ，全班同学要配合好，每次运转务必满负荷. 细胞生物学实验细胞生物学实验 1.分别别描述六张张装片的结结果(如逐级级分离中看到 哪些细细胞组组分，平均每个视视野中所见见完整的细细胞 核数量,完整的细细胞或带带有残留细细胞质质的细细胞核 的约约占多少，等) 2.根据你的实验结实验结 果和你所获获得的知识识,你认为认为 用此分离方法所分离的线线粒体的纯纯度如何?有什 么改进进方法？ 3.绘绘出人口腔粘膜上皮细细胞图图

11、(示线线粒体的形态态 与分布) 实验报告 细胞生物学实验细胞生物学实验 细胞器分离的过程包括两个主要阶段： 破碎细胞 细胞组分的分离 常用的细胞破碎方法 方 法 技术 原理效 果 成本举例 机 械 法 匀浆法细胞被搅拌器劈碎或 受剪切力而破碎 适中适中动植物组织或细胞 研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜植物组织 超声波法用超声波的空穴作用 使细胞破碎 剧烈昂贵细胞悬浮液小规模处理 珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠 捣碎 剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞大 规模处理 化 学 法 渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏 酶消化法细胞壁或细胞膜被消 化，使细胞破碎 温和昂贵动植物细胞 增溶法表面活性剂溶解

12、细胞 膜 温和适中破碎大肠杆菌 脂溶法有机溶剂溶解细胞壁适中便宜甲苯破碎酵母细胞 碱处理法碱的皂化作用使细胞 壁溶解 剧烈便宜破碎大肠杆菌 细胞生物学实验细胞生物学实验 离心分离技术 离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分 离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体 积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离 。 分离各种细胞组分的方法主要有： 差速离心 密度梯度离心 l速率-区带梯度离心 l等密度离心 细胞生物学实验细胞生物学实验 差速离心 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的 细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒 仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心

13、速度离心悬浮液，将 较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内 的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取 细胞生物学实验细胞生物学实验 密度梯度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续 的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的 顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分 层、分离的方法。这类分离又可分为速率-区 带梯度离心和等密度梯度离心两种。 优点是一次离心可分离提纯样品中几种组份， 用于较精细的分离。 细胞生物学实验细胞生物学实验 速率-区带梯度离心和等密度梯度离心 原理：根据分离的粒子在梯度 液中沉降速度的不

14、同沉降速度的不同，通过离 心力场的作用，使不同的颗粒 在密度梯度层内形成一系列区 带，从而达到彼此分离的方法 。 A、速率-区带梯度离心流程图 B、等密度梯度离心流程图 原理：根据不同颗粒在密度梯度介质 中存在着浮力密度差浮力密度差，在离心力场作 用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起 ，一直移动到与它们各自的密度恰好 相等的位置上形成区带，从而使不同 浮力密度的颗粒得到分离的方法。 两种密度梯度离心方法的异同 特 点速率-区带梯度离心等密度离心 分离方法的主要依据主要依赖分离的粒子在梯 度液中沉降速度的不同沉降速度的不同 依赖于样品颗粒的不同密度来进行 离心分离的 介质密度梯度选择 最大密度必须小

15、于样品中 粒子的最小密度；梯度平 缓 覆盖了待分离物质的密度；梯度陡 度较高 离心介质的主要作用减缓颗粒扩散速度阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒 分辨率范围沉降系数相差20%的物 质 颗粒密度差异大于1% 离心后区带形成位置易变(样品易扩散）不变（样品不扩散） 影响样品区带形成的主要因素离心时间（过长或过短都 不利） 颗粒样品密度 一般操作方法介质梯度应预先形成 ， 离心前将样品小心铺放在 密度梯度溶液表面，离心 后形成区带。 介质梯度不需预先制备，离心时把 密度均一的介质液和样品混合后装 入离心管，通过离心自形成梯度， 让颗粒在梯度中进行再分配。 常用介质蔗糖、甘油蔗糖 、甘油、 CsCl、硫酸铯、溴 化铯、三碘苯衍生物等。 细胞生物学实验细胞生物学实验 表1:各种亚细胞构造在不同的离心介质中分离所需的离心力与时间 结结 构构 差速离心差速离心 ( (在在0.25M0.25M蔗糖溶液中蔗糖溶液中) ) 速率速率- -区带梯度离心区带梯度离心 (5 (5 50%蔗糖蔗糖) ) 等密度离心等密度离心 ( (其他介质其他介质, ,如如CsClCsCl等等) ) 细胞核800-1000g 10min500g 10min4000g 60min 线粒体10,000g20min5000g 10min80000g100min 溶酶体10,000g20min5000g