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1、结核及耐药结核自动化检测技术 2 Cepheid 我国结核现状 结核诊断新技术 2015 WHO结核诊断指南更新 2014年全球结核发病率 来源：WHO 2015年工作报告 2014年中国新发病例：826155 2014年中国结核发病率：68/100 000 近几年我国结核发病率逐年下降，但仍然属于结核高负担国家 2014年全球耐药结核发病率 来源：WHO 2015年工作报告 新发结核病例中的耐药结核比例 WHO估算2014年中国耐药结核发病数 新发病例：43000 复发病例：8200 我国属于耐药结核 高负担国家 高负担国家的耐药结核发现 我国当前耐药结核防控的问题： 不充分的耐药病人发现，
2、不充足的耐药病人治疗 5.56% 纳入治疗 结核诊治出现偏差！ n过多依赖X-光片或其他影像学检查，忽略了以痰标本为基础的微生物 诊断 n过多依赖未经验证、或不能作为诊断依据的测试，比如血清学检查 n只参考传统的微生物检测结果 因为这些检测的不可靠性，WHO 不得不采取非常规手段，特别提出反 对这些测试的建议 全球结核控制不理想的问题出在哪里？ 可诊断活动期结核感染 无法区分活动期结核与潜伏期结核 传统技术现代技术 影像学涂片镜检培养皮肤菌素试验IGRA分子诊断 结核诊断的常见技术 n依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性 敏感性为50% 结核/非结核分枝杆菌不能区分（NTM可能占到40%）
3、n以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响 2个月才获得药敏结果，导致患者脱落 2个月后调整治疗方案，导致耐药患者的漏诊和传播 n无法更早确诊耐药结核患者 当前临床诊治的难点 9 Cepheid 我国结核诊断现状 结核诊断新技术 2015 WHO结核诊断指南更新 结核诊断新技术 IGRA T-Spot QuantiFeron NAAT技术 等温扩增检测技术 线性探针 基因芯片 熔解曲线 巢式PCR 血清学检测 IGRA 原理：机体感染过结核分枝杆菌，T-淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌时，产生和分泌特异性的细胞因子IFN- 操作步骤： 1.反转10次混匀 2.37C条件下孵育16-24小时 3
4、.2000-3000g离心15分钟 4.用移液管取血浆 5.每个孔内放50ul结合液 6.加入50ul血浆，室温孵育120分钟 7. 洗板至少6次 8.每个孔内加100ul底物，室温孵育 30分钟 9.加入50ul反应终止液 10. 450nm波长下读取吸光度 11. 使用专用软件计算结果 操作步骤： 1.密度梯度离心分离外周血单个核 细胞（PBMCs） 2.洗涤PBMCs 3.将PBMCs与特异抗原一同加入到 预包被抗-干扰素抗体的培养孔 4.37C孵育16-20小时 5. 洗涤培养孔 6.加标记二抗 7. 孵育1小时 8. 洗涤培养孔 9.加显色液 10. 用蒸馏水终止反应 11. 用肉眼
5、判断结果 QuantiFERON-TBT-SPOT.TB 采血量： 2岁儿童：2-3ml 免疫力低下患者：6-8ml 其他患者：4-6ml 采血量：0.8-1.2ml 两者均有大量手工操作步骤，操作要求高 QFT低采血量，更具优势 IGRA IGRA适用于高收入、结核低负担国家的潜伏结核筛查 在中低收入国家，尤其是结核高负担国家，不推荐使用IGRA 将IGRA写入国家诊疗指南的有： 美国、加拿大 、英国、法国、西班牙、德国、意大 利、瑞士、荷兰、丹麦、挪威、芬兰、爱尔兰、葡 萄牙、捷克共和国、斯洛伐克、波兰、保加利 亚、 克罗地亚、澳大利亚、沙特阿拉伯、韩国、日本 WHO的推荐 欧美发达国家
6、或/和 结核低负担国家 2011年，IGRA在中低收入国家的政策声明 环介导等温扩增 设备要求较低 操作复杂，人工判读结果 环介导等温扩增 中国CDC推荐可用于基层实验室 无耐药检测 WHO推荐 对于持续有肺结核症状的成人可替代涂片（条件性推荐） 可作为持续有肺结核症状的成人的，可作为涂片的后续检测（条件性推荐） 备注 适用于可开展传统涂片的实验室 不应当替代可检测结核和利福平耐药的快速分子诊断技术，尤其是耐药结核高危人群 由于缺乏证据，TB-Lamp对于持续有肺结核症状的HIV患者的诊断价值，是否优于涂片尚不清楚 TB-Lamp 的推荐只适用于检测持续有肺结核症状的患者的痰液样本 TB-La
7、mp对儿童患者的检测由于缺乏数据，仅是推测 恒温扩增 试纸条法 操作步骤： 1.将痰液液化、离心、灭活，制备成核酸扩增 模板液 2.取0.4ul移入1.5ml PCR管中，放入恒温装置 中扩增 3.使用水浴锅或金属浴；63扩增1小时； 4.将完成扩增的PCR管放入一次性防污染扩增 物试纸条检测装置中检测, 15分钟目测定性 结果 无需昂贵的仪器 无耐药检测 手工操作相对较少 WHO未评估或推荐 恒温扩增 试纸条法 WHO在2015工作报告新技术章节中提到该技术 但说明目前该技术没有WHO评估并进行推荐所必须的多中心评估的数据 实时荧光RNA恒温扩增检测技术 RNA检测技术，高灵敏度，可区分活菌
8、和死菌，适用于疗 效监测 需配备超声波仪，且仍需要实时荧光PCR仪检测 无耐药检测 WHO未评估或推荐 手工操作步骤相对较少 线性探针 标本制备PCR反应杂交结果判读 结果需要人工判读，或配备专门的设备 WHO 2008年推荐用于涂阳标本检测MDR，2013年更新 推荐检测二线药物 全程检测需6-8小时 配套设备繁多，需3个房间，需PCR仪、杂交仪等 手工操作步骤繁多，复杂的结果判读 基因芯片 基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰液样本中结核杆菌的两种一线抗结核药耐药 利福平、异烟肼 WHO未评估或推荐 鉴定与药敏需用两套试剂盒，鉴定药敏各需6小时 配套设备：需不同
9、PCR室，需PCR仪、杂交仪、扫描仪等，需配备扫描仪及配套软件判读 熔解曲线 原理：一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定，发生错配时，Tm值下降，下降幅 度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关 2-3小时获得结果，目前通过CFDA的有利福平和异烟肼耐药两套试剂盒 WHO未评估或推荐 配套设备：核酸提取仪、PCR仪等 核酸提取扩增检测结果 分子信标 靶序列 杂交体 每个探针用不同的荧光染料标记，允许同时检测。 PCR的目标是rpoB基因的81 bp区域： 5个探针结合到野生型，而不是突变体目标 SPC 半巢式实时荧光PCR（Xpert） WHO与与FINDFIND支持研发成支
10、持研发成果果 痰标本与处 理液 1：2混合 吸取2ml处理 样品 到反应盒 将反应盒放入检 测模块（手工操 作完成） 标本自动 清洗过滤 超声裂解 DNA提纯 DNA和 PCR反应 试剂混合 半巢式实 时荧光定 量核酸扩 增检测 打印 检测 报告 获得检测结果时间：1小时 45分钟 系统内自动完成 Its a development that the world has been waiting for, for literally decades. Its something that has the potential of truly revolutionizing the way we
11、 deal with TB today. WHO Endorsement of Xpert MTB/RIF The Test that is Changing the World Dr. Mario Raviglione. Director, Stop TB, WHO 2011年WHO评估完成后正式推荐 WHO全力推荐Xpert 各类分子诊断技术比对 （液体培养/DST为金标准） 线性探针基因芯片恒温扩增 （试纸条法） RNA恒温扩增LAMP熔解曲线Xpert MTB/RIF 是否WHO推荐耐药结核诊断否否否否否 结核及耐药结核 初始诊断 仪器通量 12（手工） 20或48（自动） 6或12（
12、选用杂交仪 可同时做12个样品） 单个通量取决于扩增仪纯手工操作961-80 出报告时间6小时6小时2小时2小时2小时2-3小时2小时 试剂储存条件部分试剂需冷冻部分试剂需冷冻部分试剂需冷冻部分试剂需冷冻室温储存部分试剂需冷冻室温储存 涂阳培阳样本 MTB灵敏度 无 无 84.1%5 84.6%6 98.2%7 80%898%3 涂阴培阳样本 MTB灵敏度 无 无 59.8%5 61.9%6 55.6%7 81%868%3-88.8%2 耐药灵敏度 RIF：93.1%-98%1 INH： 85%3 RIF：91.8%-94.6%4 INH： 70.2%-78.1%4 无无 无 RIF 95%3
13、 1.陈琛等. 分子线性探针测定法杖结核病诊断中的研究进展. 中国防痨杂志. 2016(38): 218. 2.Xichao Ou et al. A feasibility study of the Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Disease. 2015 (31): 41. 3.WHO. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary
14、 TB in adults and children Policy Update. 4.Guo, Y et al. Rapid, accurate determination of multidrug resistance in M. tuberculosis isolates and sputum using a biochip system. International Journal of Infectious Disease. 2009 (13): 914. 5.Xichao Ou et al. A multicenter study of Cross-Priming Amplific
15、ation for tuberculosis diagnosis at peripheral level in China. Tuberculosis. 2014 (94): 428. 6.黄芳等. 三种分子生物学诊断技术对结核诊断价值的比较. 中华结核和呼吸杂志. 2015 (38): 680. 7.WHO. The use of a commercial loop-mediated Isothermal amplification assay (TB-Lamp) for the detection of tuberculosis. May 2013. 8.王冰冰. 荧光PCR熔解曲线法在结
16、核分枝杆菌耐药检测中的临床应用. 国际检验医学杂志. 2015(35): 608. 文献：3种分子诊断方法比对 无论涂阳培阳还是涂阴培阴，Xpert的检出率均最高 样本：根据“结核病诊断和治疗指 南”，收集2014年4-7月西安市结 核病胸部肿瘤医院收治的经病理确 诊或细菌性确诊的肺结核患者痰标 本共378份。 利福平耐药检测对MDR-TB诊疗足够吗？ INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对RIF单耐药的患者，无 论INH是否耐药，都会采取与耐多药患者相同的治疗方案1。 约90%利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。 1.Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDR
