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1、 代 码： 1 0 2 6 4 研究生学号： M 0 7 0 1 0 7 1 8 1 上海海洋大掌 硕士掌位论文 题 英文题目： 专 业： 研究方向： 姓名： 指导教V S 黑鲷( A c a n t h o p a g r u ss c h l e g e l i ) 和半滑舌鳎 微卫星标记的开发 I s o l a t i o na n dC h a r a c t e r i z a t i o no fN o v e l M i c r o s a t e l l i t eM a r k e r sf r o mB I a c kS e aB r e 刍m ( A c a n t h
2、 o p a g r u ss c h l e g e l i ) a n d H a l fS m o o t h T o n g u eS o l e ( C y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ) 动物遗传育种与繁殖 分子遗传育种 罗新惠 陈懒究员 二。一。年四月 珊I I I I I I I II III I I I I I I I I I I I Il U l I I I I I I I I I I I I I Y 18 217 14 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师
3、的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：罗新熙 日期：吖口年莎月二日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 r
4、l ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 日期茹澎。罗糯日期o D 矽年6 月炒 。 一 汨 ：2 名可 噬6 i p I t 蝴牌剥 期 姓名工作单位职称备注 包振民中国海洋大学教授主席 李健黄海水产研究所研究员委员 樊廷俊中国海洋大学教授 委员 I 国家海洋局第一海洋研究 孙修勤研究员委员 所 杨红生 中国科学院海洋研究所 研究员委员 王娜 黄海水产研究所 助理研究员秘书 答辩地点黄海水产研究所答辩日期 2 0 1 0 6 8 黑鲷( A c 微卫星标记由于具有多态性高、稳定性好、信息含量大等特点被广泛应用于 生物群体遗传结构分析、系统发生和遗传连锁图谱构建等方面，因此，为了评估 鱼
5、类的遗传多样性，进行分子辅助育种以指导生产，迫切需要开发这些鱼类新的 微卫星标记。 目前最常用的获得微卫星分子标记的方法就是通过构建文库的方法获得目标 鱼类的微卫星位点。本研究运用了两种不同的方法分离了黑鲷和半滑舌鳎两种不 同鱼类的微卫星分子标记。一种是通过构建黑鲷基因组文库的方法获得微卫星序 列，另一种是利用G E N E B A N K 数据库通过搜索半滑舌鳎已知c D N A 文库的E S T 序列， 直接获得具有微卫星序列的方法。 第一种是构建黑鲷的基因组文库，通过用M S E I 酶切黑鲷的基因组，连接上酶 切特异接头，经过P C R 大量扩增后回收纯化2 5 0 一1 0 0 0
6、b p 之间的小片段，以( G T ) 。探针与小片段杂交，并用磁珠选择性吸附，富集具有小片段重复序列的微卫星片 段，1 6 过夜连接到P M D - 1 8 载体并转入大肠杆菌，挑取克隆大量培养后用特异引 物进行阳性检测，随机选取了1 4 8 个阳性克隆送样测序。测序结果用软件 S S E H U N T E R 以二碱基重复六次，三碱基重复四次的方式查找微卫星序列，同时去载 体序列，接头序列，共获得1 0 1 个含有微卫星片段的序列，这些序列经过B L A S T 比对，p r i m e r 5 0 设计引物共得到了8 3 对引物，以3 0 个个体进一步检测共得到了 3 0 个具有多态的
7、微卫星位点，这些位点的观测等位基因个数在2 到1 1 之间不等， 期望杂合度和观测杂合度在0 0 6 6 7 到0 9 0 0 0 ，0 0 6 5 5 到0 8 6 3 7 之间，有7 个 位点偏离了哈德温伯格平衡。 第二种是搜索本实验室已经构建的部分c D N A 文库的E S T 序列，共获得了2 6 7 对引物，用8 个个体进行筛选，2 4 个个体统计，最终分离出8 2 个微卫星标记，检 测出多态的比率为3 0 7 ，表明从c D N A 文库筛选得到的微卫星标记也具有较高的 多态性。相对于基因组文库，c D N A 文库获得的微卫星标记更有利于基因的定位， 但此前半滑舌鳎c D N
8、A 文库分离的标记较少，本研究开发的c D N A 文库分子标记将 更易于定位在连锁图谱上，为进一步加大半滑舌鳎的连锁图谱密度提供了材料。 半滑舌鳎和黑鲷都是我国主要的养殖鱼类，有广阔的市场前景，过度捕捞， 环境污染等问 机制问题等都 黑鲷的相关鱼 关键词：半滑舌鳎，黑鲷，基因组文库，e D N A 文库，微卫星 上海海洋大学2 0 1 0 届硕士学位论文 I s o l a t i o na n dC h a r a c t e r i z a t i o no fN o v e lM i c r o s a t e l l i t e M a r k e r sf r o mB l a c
9、 kS e aB r e a m ( A c a n t h o p a g r u s s c h l e g e l i ) a n dH a l fS m o o t hT o n g u eS o l e ( C y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ) A BS T R A C T F o rp o l y m o r p h i s ma n dh i 曲i n f o r m a t i o n ，t h em i c r o s a t e l l i t em a r k e r sa r ew i d e l y u s e di n
10、a n a l y s i so fp o p u l m i o ng e n e t i cs t r u c t u r e ，c o n s t r u c t i o no fg e n e t i cl i n k a g em a pa n d S Oo n H o w e v e r , t h e r ea r ef e wp o l y m o r p h i s mm i c r o s a t e l l i t em a r k e r si nt h e s ef i s h e s N e wm i c r o s a t e l l i t em a r k e
11、 r sa r en e e d e du r g e n t l yi no r d e rt oa s s e s st h eg e n e t i cd i v e r s i t y o ft h e s ef i s h e sa n dg u i d et h ep r o d u c t i o nb ym o l e c u l a r - a s s i s t e db r e e d i n g Ad i n u c l e o t i d e - e n r i c h e dg e n o m i cl i b r a r y ( G T ) nw a sc o n
12、 s t r u c t e du s i n gt h ep r o t o c o l d e s c r i b e do f A c a n t h o p a g r u ss c h l e g e l i O n eh u n d r e da n df o r t y e i g h tp o s i t i v ec l o n e sw e r e s e l e c t e df o rs e q u e n c i n ga n ds e a r c h e df o rm i c r o s a t e l l i t e s 、i t l lS S R H U N
13、T E R1 3 p r o g r a m F i n a l l y , 8 3p r i m e rp a i r sw e r ed e s i g n e dt a r g e t i n gf r a g m e n t so f10 0 t O4 0 0b p u s i n gt h es o f t w a r eP r i m e r5 0 T h i r t yp o l y m o r p h i cm i c r o s a t e l l i t el o c iw e r ei s o l a t e df r o m t h eg e n o m i cl i
14、b r a r yo fb l a c ks e ab r e a mf r o mt h i r t yi n d i v i d u a l sf r o ms e v e r a la q u a c u l t u r a l p o p u l a t i o n sc o l l e c t e df r o mZ h o u s h a n ，Z h e ji a n gP r o v i c e ，C h i n a T h en u m b e ro fa l l e l e s ， o b s e r v e da n de x p e c t e dh e t e r o
15、 z y g o s i t yp e rl o c u sr a n g e df r o m2t o11 ，O 0 6 6 7t o0 9 0 0 0 ， a n dO 0 6 5 5t o O 8 6 3 7 ，r e s p e c t i v e l y S e v e n l o c id e v i a t e df r o mH a r d y W e i n b e r g p r o p o r t i o n sa f t e rB o n f e r r o n ic o r r e c t i o n ( P 0 0 0 16 ) T h e s em i c r o
16、 s a t e l l i t e ss h o u l db e u s e f u lf o rp o p u l a t i o ng e n e t i c ss t u d i e sa n dl i n k a g em a p p i n gi nb l a c ks e ab r e a m M i c r o s a t e l l i t es e q u e n c e sw e r es c r e e n e df r o mt h r e ee D N Al i b r a r i e so fC y n o g l o s s u s s e m i l a e v i si no u rl a b o r a t o r y 2 6 7p a i r so fp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oa m p l i f yp r o d u c t s
