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1、山东农业大学 硕士学位论文 鸡褪黑激素受体基因的多态性及其在不同组织中表达量的研究 姓名：李晓宁 申请学位级别：硕士 专业：动物遗传育种与繁殖 指导教师：唐辉 2011-06-09 山东农业大学硕士学位论文 1 中文摘要 褪黑激素（Melatonin，MEL）是松果体和视网膜分泌的一种重要内分泌激素，它在 多个物种的多个组织中广泛存在，是光照信息同生殖系统协调关系中的重要信号，光照 对繁殖机能的调节依靠褪黑激素介导，与褪黑激素受体（Melatonin receptor，MTNR） 结合来调节动物的昼夜节律和繁殖变化。本研究旨在从分子水平上了解鸡 MTNR 基因 的遗传变异以及开产前后不同组织的
2、表达差异，以便为地方鸡种的遗传改良提供依据。 研究结果如下： 以文昌鸡为研究对象，设计了多对引物，运用克隆测序及直接测序方法，分别扩增 MTNR1A、MTNR1B 和 MTNR1C 三个受体基因的 5UTR 和外显子区域，并与文昌鸡的 产蛋性状做关联分析。结果表明：MTNR1B 受体基因的 5UTR 存在 14 个 SNPs 以及 1 个插入缺失位点。其中-778 位点突变基因(AG)对文昌鸡中期(22-31 周龄)产蛋数和 46 周龄总产蛋数的显性效应分别为达到了 2.3 枚和 6.2 枚。 对后期(32-46 周龄)产蛋数和 46 周龄总产蛋数而言，-216 位点 C 对 A 为优势等位基
3、因，加性效应值分别为 2.5 枚和 3.2 枚；显性效应分别为 3.5 枚和 6.8 枚，且表现为超显性。两个位点的单倍型分析表明， AA 单倍型对 46 周龄的总产蛋数效应值在 4 种单倍型中最低；AA/AA 合并基因型母鸡 的开产日龄显著晚于 AC/AA 和 GC/GC 基因型个体(P PIC0.25 为中度多态，PIC0.25 为低度多态。 PIC=1- n i i=1 P 2 （ ）- n-1n 22 ij i=1 j=i+1 P P 2 以上式子中，Pi、Pj分别为群体中第 i、j 个等位基因频率，n 为等位基因数。 （5）加性效应(Additive effect)和显性效应(Dom
4、inant effect)：等位基因的加性效应是用 2 个纯合子离差的均值来计算； 等位基因显性效应是用杂合子与 2 种纯合子均值的 离差来计算， 其中，AA、AB 和 BB 为基因型(Falconer 等，1996)。 加性效应=(BB-AA)/2 显性效应= AB-(AA+BB)/2 (四)数据统计与分析 统计每只鸡的开产日龄，开产至 21 周龄(前期)、22 至 31 周龄(中期)、32 至 46 周龄(后期)以及开产至 46 周龄(全期)的产蛋数。 对多态位点的基因型与产蛋量和开产日龄进行关联分析，统计模型为： Yijk=+i+j+eijk，其中 Yijk为性状观察值， 为群体均值，i
5、为基因型效应值，j为 群组效应值，eijk为随机残差效应。用 SAS8.2 软件包的 GLM 程序进行方差分析，估 计不同基因型的最小二乘均值，计算基因的加性效应、显性效应并进行显著性检验； 用 R 软件中的 Genetics 包计算多态位点的基因频率、基因型频率、杂合度、有效等 位基因含量和多态信息含量。 褪黑激素受体基因相对定量表达结果的统计分析， MX3000P 定量 PCR 仪自动生 成目的基因和内标基因的 Ct 值，并据此计算 2-Ct值。数据统计采用 SAS8.2 统计软 件包的 GLM 程序进行基因表达量的相关分析。统计分析模型为：Yij=+i+eij，其中 Yij为褪黑激素受体
6、基因 mRNA 的相对表达量(2-Ct)效应值，i代表不同组织的效应 值开产前后的效应值，eij为随即残差效应。不同组织开产前后之间的比较分析用最 山东农业大学硕士学位论文 29 小二乘法，试验数据用最小二乘均值标准误表示 (LSMSE)，显著水平设定为 P0.05。 2.2.2 褪黑激素受体基因定量表达的研究 2.2.2.1 定量表达的引物设计 根据 GenBank 上发表的鸡MTNR1A(GenBank Accession no: NM_205362)基因、 MTNR1B(GenBank Accession no: XM_417201)基因、MTNR1C(GenBank Accession
7、 no: NM_205361)基因和-Actin(GenBank Accession no: NM_205518)基因的 mRNA 序列，应 用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件设计了四对跨内含子的用于定量的引物(见表2)。 表 2 引物序列及退火温度 Table 2 Primers sequences of PCR and annealing in this study 引物 Primer 引物序列 Sequences 产物长度 Length/bp 退火温度 Tm/ MTNR1A F：ACGCGGGAAATATATTTGTGG R：CCCAGATTCCATCCATTGTG
8、 109 58 MTNR1B F：CTCAGGTAATGCATTTGTGGTG R：CAAAGCCACTCACTTTACAGTGC 136 58 MTNR1C F：AACGCCGGCAACATCTTT R：CCCATCAGGAACCCACTTATC 146 55 -Actin F：ATATTGCTGCGCTCGTTGTT R：TAGCTGTCTTTCTGGCCCAT 148 58 2.2.2.2 实时荧光定量PCR反应体系 实时荧光定量 PCR 采用 SYBR GreenI 染料法，采用 TIANGEN 公司的 Real MasterMix(SYBR Green)试剂盒方法进行。反应在 Str
9、atagene MX3000P 荧光定量 PCR 仪 上进行。反应体系为 20L，体系成分见表 3。 鸡褪黑激素受体基因的多态性及其在不同组织中表达量的研究 30 表 3 荧光定量 PCR 反应体系 Table 3 There action system of qRT-PCR 2.2.2.3 总RNA的提取及反转录 (一)前处理 凡与 RNA 操作有关的玻璃器皿和剪刀、镊子等器械经常规洗涤烘干后，用锡 箔纸包好，180烘烤 4-5h，塑料制品均用灭菌的无 RNase 酶污染的。 (二)总 RNA 提取 （1） 匀浆处理：每 10-20mg 组织加 300L 裂解液 RL（使用前请先检查是否已加
10、入 - 巯基乙醇，1mL l 裂解液中加入 10L -巯基乙醇，此裂解液最好现用现配） ，用 研磨杵将组织彻底研磨；随后向匀浆液中加入 590L RNase-free ddH2O 和 10L 蛋白酶 K，混匀后 56处理 10-20min； （2） 12,000rpm（13,400g）离心 2-5min，取上清进行以下操作； （3） 缓慢加入 0.5 倍上清体积无水乙醇，混匀（此时可能出现沉淀） ，得到的溶液和沉 淀一起转入吸附柱 CR3 中（吸附柱放在收集管中)，12,000rpm 离心 30-60s，弃掉 收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中； （4） 向吸附柱 CR3 中加入 350L
11、去蛋白液 RW1，12,000rpm 离心 30-60s，弃废液， 将吸附柱放回收集管中； （5） DNaseI 工作液的配置：取 10L DNaseI 储存液放入新的 RNase-free 离心管中， 加入 70L RDD 溶液，轻柔混匀； （6） 向吸附柱 CR3 中央加入 80L DNaseI 工作液，室温放置 15min； （7） 向吸附柱 CR3 中加入 350L 去蛋白液 RW1，12,000rpm 离心 30-60s，弃废液， 将吸附柱放回收集管中； 组分 Component 体积 Volume/L 2.5Real Master Mix/20SYBR solution 9 For
12、ward Primer(10M) 0.4 Reverse Primer(10M) 0.4 cDNA 1 ddH2O 9.2 山东农业大学硕士学位论文 31 （8） 向吸附柱 CR3 中加入 500L 漂洗液 RW（使用前请先检查是否已经加入乙醇） ， 室温静置 2min，12,000rpm 离心 30-60s，弃废液，将吸附柱 CR3 放回收集管中； （9） 重复以上步骤一次； （10）12,000rpm 离心 2min，倒掉废液，将吸附柱 CR3 置于室温放置数分钟，以彻底晾 干吸附材料中残余的漂洗液； （11）将吸附柱 CR3 转入一个新的 RNase-free 离心管中，向吸附膜的中间部
13、位悬空滴 加 30-100L RNase-free ddH2O， 室温放置 2min， 12,000rpm 离心 2min， 得到 RNA 溶液，于-70保存。 （三）RNA 纯度及浓度检测 （1） 完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度 1.2%：0.5TBE 电 泳缓冲液：150V，15min）检测完整性。由于细胞中 70%-80%的 RNA 为 rRNA， 电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rRNA 条带。 28S rRNA 的量约为 18S rRNA 的 两倍，说明 RNA 的完整性较好。 （2） 纯度： OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。 高质
14、量的RNA， OD260/OD280 读数在 1.8-2.1 之间，比值为 2.0 是高质量 RNA 的标志。OD260/OD280读数受测定 所用溶液的 pH 值影响。同一个 RNA 样品，假如在 10mM Tris，pH7.5 溶液中测 出的 OD260/OD280读数 1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在 1.5-1.9 之间， 但这并不表示 RNA 不纯。 （3）浓度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free ddH2O 稀释 n 倍，用 RNase-free ddH2O 将分光光度计调零，取稀释液进行 OD260，OD280测定，按照以 下公式进行 RNA 浓
15、度的计算： 终浓度（ng/L）=（OD260）（稀释倍数 n）40 （四）用 DNaseI，RNase-free 去除 RNA 中的 DNA （1）取 1g 的 RNA，10reaction buffer with Mgcl2 1L，DNaseI，RNase-free 1L，加 DEPC-treated Water 到 10L，放入一个 RNase-free 管中； （2）37保温 30min； （3）加 1L 50mM EDTA，65保温 10min； （4）用准备好的 RNA 做模板进行反转录。 (五）反转录获得 cDNA 20L反应体系： 首先混合总RNA 1pg-5g， 5Reacti
16、on Mix 4L， MaximaTM Enzyme 鸡褪黑激素受体基因的多态性及其在不同组织中表达量的研究 32 Mix 2L，nuclease-free 的水到 20L 放入 RNase-free 的管中混匀，放置在冰上操作， 按照 25保温 10min，然后 5015min，最后 85加热 5min 结束反应。 2.2.2.4 褪黑激素受体基因和-Actin基因标准曲线的制作 对用于定量的每个模板取等量 cDNA 混匀到一个 PCR 管内，依次进行 2 倍梯度稀 释，制作 5 个浓度梯度(即：原始浓度、2、4、8、16)。目的基因和持家基因均按 照上述 PCR 步骤进行扩增，得到标准曲线。根据斜率(k)计算出扩增效率，计算公式为： 扩增效率 e=101/(-k)-1。当目的基因的扩增效率和持家基因的扩增效率相近时(即二者的斜 率相差不超过 0.2)，可以使用“平均相对含量=2-Ct”法来计算该基因的相对表达量。具 体计算
