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1、分类号 华中农业大学硕士学位论文 密级 鸡毒霉形体黏附素蛋白黏附特性及粘膜免疫研究 S t u d i e so na d h e s i v ec h a r a c t e r i s t i c sa n dm u c o s a li m m u n i t yo f t h ep r o t e i no fM y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u mA d h e s i n 研究生：王晓丽 指导教师：毕丁仁教授 指导小组：毕丁仁 李自力 胡思顺 肖运才 石德时 栗绍文 教授 副教授 副教授 副教授 副教授 副教授 专业：预防兽医学研究
2、方向：兽医微生物与免疫学 获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学动物科技学院动物医学院 二。一。年六月 华中农业大学学位论删性声明及使用眦Y 1 7 9 9 8 9 2 学偷论文 压 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表
3、示了谢意 研究生签名： 互朦孬f I 时闽： 汐p 年 月7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表传播学位论文的全 都或部分内容同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商韭秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 ， 学位做储张立兢砀导师鲐 缈 蛳期：咖f 月 日 期：年月夕
4、日 注：请将本袁直接装订往学位论文的廊页和目录之间 鸡毒霉形体黏附素蛋白黏附特性及粘膜免疫研究 目汞 摘要I A b s t r a c t I I 缩略语表( A b b r e v i a t i o n ) 。I V 第一章文献综述l l 霉形体概述1 2 鸡毒霉形体病的研究1 2 1 病原1 2 2 流行病学1 2 3 症状及病理变化2 2 4 诊断方法研究2 2 5 致病机理3 2 6 免疫机制4 2 7 防制4 3 鸡毒霉形体蛋白研究进展5 3 1 鸡毒霉形体结构蛋白的研究5 3 2 鸡毒霉形体黏附素蛋白研究6 4 家禽粘膜系统研究进展8 4 1 家禽粘膜免疫系统的组成8 4 2
5、家禽粘膜免疫系统的特点9 4 3 家禽粘膜免疫系统的功能9 4 4 家禽粘膜免疫在抗感染中的作用9 4 5 家禽粘膜免疫系统的效应分子一s I g A 1 0 4 6 粘膜免疫的途径1 0 4 7 粘膜免疫佐剂( C T B ) 研究进展1 l 第二章鸡毒霉形体黏附素蛋白p M G A l 2 及霍乱毒素B 亚基的表达。1 3 l 目的与意义1 3 2 材料与方法1 3 2 1 实验材料1 3 2 2 实验方法15 3 结果与分析1 9 3 1 重组表达质粒的鉴定1 9 3 2 重组蛋白p K G p M G A l 2 和p K G c t b 表达产物的S D S P A G E 结果1
6、9 3 3 重组蛋白p K G p M G A l 2 表达产物的W e s t e r n b l o t 检测结果2 0 3 4 重组蛋白p K G c t b 表达产物的G M l E L I S A 检测2 l 4 讨论2 l 5 J 、结：! ：! 第三章鸡毒霉形体黏附素蛋白p M G A l 2 黏附特性研究2 3 1 目的及意义2 3 2 材料与方法2 3 2 1 实验材料2 3 2 2 试验方法2 5 3 结果与分析2 6 3 1 菌株纯化及记数结果2 6 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 3 2 黏附抑制试验结果2 6 4 讨论2 8 5d 、结2 9 第四章鸡毒霉
7、形体黏附素蛋白p M G A l 2 粘膜免疫效果测定3 0 1 目的与意义3 0 2 材料与方法3 0 2 1 实验材料3 0 2 2 实验方法3 0 3 结果与分析3 2 3 1E L I S A 检测结果3 2 3 2 免疫效力测定实验结果3 5 4 讨论3 8 5 小结3 9 参考文献4 0 致谢4 6 J 鸡毒霉形体黏附素蛋白黏附特性及粘膜免疫研究 摘要 鸡毒霉形体( M y c o p l a s m ag a l l i s e p t i c u m ，M G ) 是引起禽类慢性呼吸道病( C h r o n i c R e s p i r a t o r yD i s e a
8、 s e C R D ) 的病原，虽然不会引起鸡群大量死亡，但是可导致鸡群产 蛋量下降、孵化率、饲料转化率降低等，给养禽业带来了严重的经济损失。 目前该病的主要防治措施是接种疫苗，由于弱毒苗和灭活苗本身存在一些不足， 因此新型基因疫苗的研制备受关注。研究表明，M G 是借助其表面的黏附素蛋白 ( p r o t e i no f M y c o p l s m ag a l l i s e p t i c u mA d h e s i n ，p M G A ) 吸附到宿主细胞上，进而发挥 致病作用。p M G A 是一种主要的原生质膜蛋白，具有血凝素活性。本研究对实验室 保存的M G H S
9、株p M G A l 2 基因进行表达，经w e s t e r n b l o t 检测和体外气管纤毛吸 附试验研究其免疫原性和黏附特性。采用原核表达的重组霍乱毒素B 亚基( C h o l e r a t o x i nB s u b u n i t ，C T B ) ( r C T B ) 作为粘膜免疫佐剂和p M G A l 2 重组蛋白( r p M G A l 2 ) 一起免疫实验动物，并对其免疫效果进行了评价。主要试验结果如下： 1 M G 黏附素蛋白基因( p M G A I 2 ) 和霍乱毒素B 亚基基因( c t b ) 的表达 表达纯化了r p M G A l 2 和r
10、C T B 蛋白。经S D S P A G E 电泳分析，其表达产物条 带大小均与预期的一致( r p M G A l 2 约9 2 0 K d a ，r C T B 约3 8 0 K D a ) ，其中r p M G A l 2 主要以可溶性蛋白的形式存在，而r C T B 主要以包涵体的形式存在。经W e s t e r nb l o t 和神经节苷脂( G M l ) 结合试验证明：r p M G A l 2 和r C T B 都具有良好的免疫学活性。 2 鸡毒霉形体黏附素蛋白p M G A I 2 黏附特性研究 鸡胚气管环在含1 0 犊牛血清的D M E M 培养基中生长状态良好，电镜
11、扫描结果 显示当r p M G A l 2 使用剂量为1 0 0 I - t g 时对M G 导致的鸡气管纤毛脱落抑制作用最好， 说明r p M G A l 2 参与了M G 的吸附过程。 3 鸡毒霉形体黏附素蛋白p M G A I 2 粘膜免疫效果测定 r p M G A l 2 混合粘膜免疫佐剂r C T B 通过滴鼻点眼的途径共同免疫试验鸡， E L I S A 结果表明：免疫后血清中能产生特异性的I g G 及s l g A 抗体，但是s l g A 抗体 水平较低；鼻冲洗液和气管冲洗液中r C T B + r p M G A l 2 组与r p M G A l 2 组s I g A 抗体 水平差异显著( P 0 0 5 ) ，r C T B + r p M G A I 2 不同剂量组( 1 0 I - t g ，2 0 1 x g ) 间差异不 显著，且鼻冲洗液中s I g A 抗体水平较气管冲洗液略高。攻毒试验结果： r C T B + r p M G
