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1、攻读学位期间发表的学术论文- ”4 3 原创性声明4 4 专业：老年医学 导师：亓文波教授 中文摘要 目的 本实验采用不同的葡萄糖浓度的培养液以及甘露醇培养液孵育人单核 巨噬细胞，观察在不同的环境中单核巨噬细胞表达M M P 9 的不同，探讨不 同的葡萄糖浓度及糖浓度波动对单核巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶9 ( M M P 9 ) 的影响以及渗透压改变是否参与了这一过程。旨在探讨高糖及糖 波动促发糖尿病大血管病变的作用机制，为糖尿病大血管并发症的治疗提供 新的方向及理论依据。 方法 1 T H P 1 细胞的培养：于8 0 冰箱中取出T H P 1 细胞株，在超净工作台 内解冻复苏后接种于培养瓶
2、中，置于5 C 0 2 培养箱中孵育( 3 7 。C ) 。培养的 单核细胞采用胎盘蓝染色法计算细胞活率。 2 单核巨噬细胞的获得：T H P 1 细胞在培养至浓度为l0 5 m l 时经乙酸肉 豆蔻佛波酯( PMA ) 孵育4 8 后被诱导成单核巨噬细胞。 3 单核巨噬细胞的鉴定：采用鸡红细胞吞噬法对单核巨噬细胞进行功能 鉴定。 4 实验分组：根据葡萄糖浓度及其变化分为对照组( 5 m m o l L ) 、高葡萄 糖组( 1 5 m m o l L ) 、葡萄糖浓度波动组( 5 1 5 m m o l L ) 及渗透压控制组( 甘 露醇浓度5 1 5 m m o l L ) 。 5 M M
3、 P 9 的检测：R T - P C R 测定各组M M P 9m R N A 的表达，并比较各 组间有无统计学差异。 结果 1 高糖组、糖波动组及甘露醇组单核巨噬细胞内M M P 9 的表达均明显 高于对照组( P 7 8m m o l L ) 的时间百分比、血糖曲线下面积等。然而，常规的血糖检测法难 以精确地检测出这些血糖指数。动态血糖监测技术的问世，突破了传统检测方 法的非连续性为精确地评估受试者全天的血糖波动趋势及细节变化提供了 便利。动态血糖监测系统( c o n t i n u o u sg l u c o s em o n i t o r i n gs y s t e m ，C
4、G M S ) 能够 监测受试者2 4h 血糖的漂移变化【2 0 2 1 1 。C G M S 以每5m i n 间隔连续测定机 体血糖值，每2 4h 监测2 8 8 个血糖数据呈现出全天的血糖变化谱。 C G M S 评估2 型糖尿病血糖水平的波动变化主要包括一日之内和每同之 间的血糖波动幅度。常用的评估日内血糖波动幅度的参数主要有：日内平均 血糖波动幅度( M A G E ) 、血糖的标准差( S D ) 及血糖最高值和最低值的差值。 其中血糖的S D 反映所有血糖的离散程度，但无法区分主要的和细微的血糖 波动；血糖最高值与最低值得差值主要观察单一的血糖波动，反应日内血糖 最大的波动幅度；
5、而M A G E 则评估大于一个标准差，主要与进餐相关的血糖 波动幅度，能更好的反映2 型糖尿病患者R 内血糖的波动变化。评价R 问血 糖波动的参数是日间血糖平均绝对差( M O D D ) 。 临床检测技术的不断革新发展，为进一步评估糖代谢紊乱的程度提供了 便利。C G M S 客观地呈现了糖尿病患者在日常生活状态下全天血糖增高的幅 度及变化趋势，因而比常规血糖检测法能更为详细地显示出糖尿病患者与正 常人血糖漂移的不同。当然我们也应该看到C G M S 作为一种新的血糖监测方 法还处于早期的发展阶段，其可监测的范围只为2 2 2 2 2 r n o l L ，且组织液的 葡萄糖浓度的变化较血
6、糖有一定的滞后性，因此，评价血糖波动的方法还有 待进一步完善。 许多流行病学研究显示血糖波动与糖尿病大血管并发症密切相关，德国 一项研究选取了5 8 2 位4 0 - 7 0 岁糖尿病患者，观察其血糖与颈动脉内膜中层 厚度( I M T ) 的关系，发现I M T 与负荷后血糖峰值呈正相关，与H b A lC 无明显相 关性，仅当血糖波动较大( 负荷后血糖升5 0 6 - 11 0 4m m o l L ) 时H b A lC 才与 I M T 成正比( P 0 0 0 1 ) 。负荷后血糖峰值增加使I M T 进展的危险高达 1 5 0 ( O R = 1 5 ，9 5 C I1 0 8 2
7、 1 0 ，P 0 0 5 ) ，说明波动性高血糖加速动脉粥样硬 化病变的进展【22 1 。O y i b o 2 3 1 利用5 C G M S 观察1 型糖尿病患者神经病变的发 生和发展与血糖增高的关系，发现神经病变的发生和发展不仅与血糖增高有 关也与血糖波动密切相关，血糖波动幅度越大者病变越重。糖波动导致C V D 及其相关并发症的危险性可能超过血糖绝对水平的作用在众多临床试验中 己得到证实。檀香山心脏研究、赫尔辛基警察研究均支持口服葡萄糖负荷后 血糖过度漂移与C V D 的危险性独立相关。且波动性高血糖可显著增加2 型 D M 患者C V D 的死亡风险。D C C T 研究比较了H
8、b A lC 值相近的强化治疗组 与常规治疗组患者微血管病变的发生率，发现自i 组发病率明显低于后组。分析 认为该研究中强化治疗组采用的是胰岛素每天多次注射或用胰岛素泵，患者 的血糖波动性相对较小，因而微血管并发症发生率低于常规治疗组。多个循证 医学都证实波动性高血糖要比稳定性高血糖对心血管并发症更具有独立的 伤害作用，波动性高血糖比慢性恒定性高血糖更易、更早出现动脉粥样硬化。 I G T 患者C V D 或冠心病的死亡风险大约是证常血糖者的两倍以上，总死亡风 险是正常血糖者的1 5 倍。 前文中已经提及餐后高血糖在血糖波动中作用重大，多项大型临床研究 如芝加哥心脏研究和D E C O D E
9、 研究等的结果均确切表明进餐后2h 血糖水平 是糖尿病心血管并发症的重要预测因素。B a l k a u 等对W h i t e h a l l 研究、P a r i s 前 瞻性研究及H e l s i n k i 研究中的2 0 年死亡率进行回顾性分析发现，在中年糖代谢 异常者中，餐后血糖水平升高是引起死亡率增高的统计学危险因素。I G T 患者 C V D 或冠心病的死亡风险大约是正常血糖者的两倍以上，总死亡风险是正常 血糖者的1 5 倍。糖尿病干预研究( D I S ) 亦表明，餐后高血糖是心梗和心脏性死 亡独立的危险因素，餐后血糖每增加1m m o l L ，该危险性增加13 。 空
10、腹血糖波动对糖尿病慢性血管并发症的影响也不容忽视。V e r o n a 糖尿 病研究对5 6 6 例大于7 5 岁的2 型糖尿病患者进行了长达5 年的随访观察。该研 究根据患者在随访开始前3 年的空腹血糖情况【包括平均空腹血糖值( M e a n f a s t i n gp l a s m ag l u c o s e ，M - F P G ) 及空腹血糖值的变异系数( C o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o no ff a s t i n gp l a s m ag l u c o s e ，C V - F P G ) 进行分组。整个随访过程中
11、共 有6 3 例男性及12 8 例女性患者死亡。该研究发现，心血管原因死亡与C V F P G 2 3 存在独立相关性，但是与M F P G 值无关。该研究小组于是又对14 0 9 例5 6 7 4 岁 的2 型糖尿病患者进行了为期l0 年的随访观察，结果提示C V F P G 是餐后血糖 波动对糖尿病慢性血管并发症的影响。 血糖波动影响糖尿病并发症的基础研究目前还比较缺乏。因此本试验采 用不同的糖浓度( 5m m o l L ，1 5m m o l L ) 及糖浓度波动( 5m m o l L 和1 5 m m o l L 每12 d , 时交替) 培育巨噬细胞，以此模拟血糖波动的体外模型，
12、分别测量血糖 波动及高血糖对巨噬细胞分泌M M P 9 的影响，结果发现：高糖环境的干预下 巨噬细胞内M M P 9 的表达量较对照组明显增高，而糖波动组M M P 9 m R N A 表 达量较高糖组显著增加。说明血糖波动更能促发炎性因子M M P 9 的表达，通 过影响平滑肌细胞迁移增殖以及斑块不稳定性，加速了糖尿病大血管并发症 的发生发展。 四、高血糖及血糖波动对单核巨噬细胞内M M P 9 分泌的影响及其可能的机制 高糖及糖波动使M M P 一9 分泌增多，分析其原因可能有以下几个方面：( 1 ) 高糖通过激活蛋白激酶C 触发了氧化应激，使对氧化应激敏感的核因子 K B ( N F K
13、 B ) 等多种细胞因子激活，启动了M M P 9 的基因转录1 24 1 。持续高糖 会使细胞产生慢性适应，通过自身反馈调节降低或部分消除了高糖毒性，问 断暴露于高浓度葡萄糖环境下，导致巨噬细胞适应能力受损，氧化应激反应 加剧，分泌更多的M M P 9 。( 2 ) 本实验还设计了甘露醇组，甘露醇与葡萄糖 分子量十分相近，但是细胞外环境中的葡萄糖可以进入细胞内在多种酶的参 与下进行代谢，而甘露醇则很少进入细胞代谢，因此，采用相同浓度的甘露 醇以及与波动组相同的方式培养细胞，相当于单纯模拟了波动组的细胞外渗 透压环境。结果甘露醇组巨噬细胞M M P 9m R N A 表达量较高糖组高，较糖 波
14、动组低。考虑高糖及糖波动对巨噬细胞M M P 9m R N A 表达的影响与渗透 压有关，但渗透压又不是唯一的影响因素，推测高糖及糖波动增加单核巨噬 细胞表达M M P 9 m R N A 的机理除了渗透压的改变外还可能存在其他途径， 有待进一步研究证实。本研究为明确M M P 9 在糖尿病A s 中的不良作用提 供了新的证据，就其机制进行了初步探讨，为将M M P 9 作为糖尿病心血管 疾病防治靶点提供了理论依据。 2 4 结论 本实验采用体外培养单核巨噬细胞的方法来检测高葡萄糖浓度及葡萄 糖浓度波动对单核巨噬细胞表达M M P 9 水平的影响，从而探讨血糖波动在 糖尿病大血管病变中发挥的作
15、用及其发生机制，通过本实验得出以下仞步结 论： 1 低葡萄糖组单核巨噬细胞可以表达M M P 9 。 2 单核巨噬细胞内M M P 9 的表达水平与葡萄糖浓度呈正相关。 3 葡萄糖浓度波动较高葡萄糖更能促进单核巨噬细胞表达M M P 9 。 4 葡萄糖浓度波动促进单核巨噬细胞表达炎性因子的作用与渗透压的 改变有关。 研究提示：血糖波动在糖尿病大血管病变过程中发挥了重要的作用，比 持续高血糖有更强的细胞毒性。其作用可能与刺激单核细胞分泌相关炎性因 子，诱导炎性细胞与血管内皮细胞的粘附有关。 附图 图lT H P 1 细胞经P M A 诱导后高倍镜下观察 图2单核巨噬细胞与鸡红细胞共孵育l O m
16、 i n 后高倍镜下观察 图3单核巨噬细胞与鸡红细胞共孵育3 0 m i n 后高倍镜下观察 图4 单核巨噬细胞与鸡红细胞共孵育6 0 m i n 后高倍镜下观察 图5 对照组高倍镜下观察 图6 高葡萄糖组高倍镜下观察 2 8 图7 葡萄糖浓度波动组高倍镜下观察 图8 渗透压控制组高倍镜下观察 图9R T - P C R 电泳结果 M ：M a r k e r ；1 ：对照组；2 ：高糖组；3 ：甘露醇组；4 ：糖波动组 O 9 O 8 O 7 O 6 O 5 O 4 O 3 O 2 O 1 0 = = I 霞 露 霪 潺 霭 鬯 234 图表1 0 四组细胞M M P 9 表达量的比较 注：各组间比较，户 o 0 1 参考文献 【1 】A m e r i c a n D i a b e
