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1、河南科技大学 硕士学位论文 高半胱氨酸血症与肺栓塞的相关性研究 姓名：和雪改 申请学位级别：硕士 专业：临床 指导教师：毛毅敏 20100501 摘 要 I 论文题目：论文题目：高半胱氨酸血症与肺栓塞的相关性研究 专 业：专 业：内科学 研 究 生： 研 究 生：和雪改 指导教师： 指导教师：毛毅敏教授 摘 要 摘 要 目的目的：本研究通过在兔高半胱氨酸血症模型基础上建立肺栓塞模型， 分 别 检 测 血 清 中 内 皮 素 -1 （ ET-1 ） 、 一 氧 化 氮 （ NO ） 、 脂 蛋 白a （Lpa）、D-二聚体（D-dimer），并行肺灌注显像及病理学检查，探讨 血浆半胱氨酸与肺栓塞
2、的相关性。 方法方法： 新西兰大耳白兔 30 只，随机分为半胱氨酸（Hcy）组和普通 组 ， 喂 养 前 两 组 均 抽 血 测 半 胱 氨 酸 ， 求 出 95%可 信 区 间 为 ： 12.81 14.31umol/L 。半胱氨酸组给予 2%蛋氨酸饲料喂养，普通组给予标准 饲料喂养，8 周后复测半胱氨酸，半胱氨酸组明显升高，普通组较前无 名显变化，高半胱氨酸模型造模成功。两组均采用自体血栓回输法建立 肺栓塞模型。于栓塞前后不同时段留血测 D-二聚体、内皮素-1、一氧化 氮、脂蛋白 a 及血气分析，并作肺灌注显像，同时作肺脏解剖进行病理 研究肺栓塞后血栓形成及其栓子分布规律和两组肺动脉及股静
3、脉的结构 异常变化。 结果：结果：1. 两组实验兔血清 Lpa、NO 于栓塞前无明显差异，栓塞后 2 小时 NO 较实验前明显下降， Lpa 于栓塞 24 小时后明显升高（P0.05）。 且半胱氨酸组变化较普通组更明显，组间比较有统计学差异（t 值分别 为-2.995， -4.544 P0.05）。 2. 两组实验兔血浆 ET-1、D-二聚体于栓塞后 2h 均明显升高，且组 间 比 较 有 统 计 学 意 义 。 （ 组 间 比 较t 值 分 别 为 -7.658、 -2.716、 P 0.015）。 3. 病理结果：大体所见 解剖实验兔肺脏均可见肺动脉栓塞,共计栓子 88 个,少于注入栓子数
4、(111 个) ，普通组多栓塞在肺动脉段以下，且以淤血 为主，Hcy 组栓塞肺动脉干为主，猝死 3 只，均栓塞至肺动脉干，且 85%出现肺梗死。HE 染色显微镜下可见：血栓栓塞肺动脉，栓塞处 肺动脉明显扩张，部分见血管内膜向血栓栓子内生长。Hcy 组肺动脉、 河南科技大学硕士学位论文 II 主动脉管腔较普通组明显变细、变窄，管壁增厚，两组股静脉无明显区 别，说明半胱氨酸可能对静脉影响较小。 4. 肺灌注显像 两组实验兔肺栓塞后肺灌注显像阳性率达 75%， Hcy 组肺灌注显像阳性率高于普通组且充盈缺损更明显。 5. 血气分析 两组于栓塞后测得 PH、PO2、PCO2，组间比较 PO2以 Hcy
5、 组下降明显，P100 umol/L。流行病学和临床研究证明，高半胱氨酸 血症是动脉和静脉阻塞性疾病的独立危险因子，是心脑血管疾病发生的合适诊断 指标，亦与妊娠并发症、神经管畸形、精神病及老年人认知能力下降有关，高半 胱氨酸血症的确切致病机制尚不十分明确，可能与以下几个方面有关。 1. 导致血管内皮的损伤 Hcy通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶的活性，减弱了 其阻止一氧化氮失活的作用；Hcy氧化产生的过氧化氢、超氧化物阴离子和羧自 由基等产物可以抑制血管内皮细胞合成和释放一氧化氮，因此可导致血管内皮功 能的异常及内皮细胞的损伤；Hcy抑制血管内皮细胞的生长和发育，体外实验发 现，Hcy对培养的血管内
6、皮细胞成剂量依赖性毒性，在半胱氨酸作用下，血管内 皮细胞成梭形，排列紊乱，当去除半胱氨酸后可恢复正常形态 2 。 2. 促进血管平滑肌细胞的增殖 半胱氨酸可通过与血管平滑肌细胞中的半胱 氨酸氧化-还原受体结合来影响其周围组织氧化-还原状态，可刺激VSMC的增殖 7。半胱氨酸可促进平滑肌细胞DNA和细胞周期蛋白基因Cydina、CydinD1的 mRNA的合成，同时并加速平滑肌细胞静止期进入细胞周期8。 3. 半胱氨酸致血栓性疾病 半胱氨酸通过破坏机体凝血和纤溶之间的平衡， 使机体处于血栓前状态。半胱氨酸还通过增强血小板的聚集功能和和组织因子的 活性，激活凝血因子、等3。 4. 影响脂质代谢及体
7、内的转甲基化反应 机体内低密度脂蛋白（LDL）的自 身氧化能影响一氧化氮的合成，导致内皮功能的受损，而半胱氨酸能加强低密度 脂蛋白的自身氧化。半胱氨酸浓度升高会影响体内许多甲基化过程，如蛋白质、 多糖、胆碱等的甲基化。 1.3 目前高半胱氨酸血症与肺栓塞相关性的研究现状目前高半胱氨酸血症与肺栓塞相关性的研究现状 同型半胱氨酸（Hcy）是一种含硫氨基酸，它是甲硫氨酸代谢过程中的一种 重要的中间产物，并涉及亚甲基四氢叶酸还原酶等多种代谢调节酶也涉及酶的多 种辅因子如叶酸、维生素 B6 及维生素 B12 等。当上述的酶基因突变或辅因子缺 乏，会导致甲硫氨酸代谢产物半胱氨酸的转化受阻，使血半胱氨酸水平
8、增高。当 血清中半胱氨酸浓度升高，超过正 第 1 章 综述 5 常对照人群的95%时称为高同型半胱氨酸血症。高半胱氨酸血症是导致血管内皮 损伤、动脉粥样硬化、血栓形成的一个危险因素。肺栓塞是静脉血栓形成常见而 严重的并发症，因此，半胱氨酸可能增加肺栓塞发生的危险。临床研究显示：血 浆中半胱氨酸升高能增加血栓形成的危险性,大约25 %的静脉血栓栓塞患者存在 半胱氨酸升高。高同型半胱氨酸血症增加了特发性静脉血栓的危险度，大约1/3 的高半胱氨酸血症个体有血栓事件发生。与正常范围血浆半胱氨酸个体相比，高 半胱氨酸血症是肺动脉血栓栓塞症的相对危险增加3.99倍。目前国内外关于半胱 氨酸与肺栓塞相关性的
9、报道主要集中在临床病人，尤其是已经发生了肺栓塞的病 人：如Ridker PM等报道血浆中半胱氨酸升高能增加血栓形成的危险性, Paul 等 研究发现高同型半胱氨酸血症增加了特发性VTE的危险度；Isabelle 等也证实深 静脉血栓或肺栓塞患者血浆中同型半胱氨酸明显升高；法国Oger E等研究指出： 高同型半胱氨酸血症与静脉血栓之间的有明显的相关性，国内叶艳平等报道，高 同型半胱氨酸血症是我国汉族人群PTE发病的危险因素，王美堂等认为Hcy是静 脉血栓栓塞的独立性的危险因素，Hcy使静脉血栓栓塞的危险性明显增高，血浆 中Hcy浓度是预示血栓栓塞危险性较好的指标。而关于大样本前瞻性研究则很少 报
10、道。众所周知，在医学研究中前瞻性随机对照研究是最具备说服力的研究模式, 但是,对于病因学的研究临床难以进行。 第 2 章 引言 6 第2章 引言 第2章 引言 肺血栓栓塞症是目前临床上常见的致死性疾病之一，肺栓塞的栓子多来源与 下肢深静脉血栓形成，每年约有 1/1000 的成年人发病，探讨肺血栓栓塞症的危 险因素，制定有效的防治策略是下世纪心血管病领域的重要任务。肺栓塞在 45 岁后发病率明显升高，男性发病率略高于女性，除了年龄，该病的主要危险因素 包括继发性因素如：外科手术、妊娠及产后、外伤、长期卧床、癌症、肥胖、激 素治疗等，原发性因素如：后天失调的高凝状态和因子 Leiden 突变等。高
11、同 型半胱氨酸血症是指血浆或血清中的半胱氨酸水平升高，超过正常值的 95%时 称为高半胱氨酸血症，高半胱氨酸血症是动脉和静脉阻塞性疾病的独立危险因 子，是心脑血管疾病发生的合适诊断指标。目前，血清半胱氨酸的升高是否能增 加血栓栓塞性疾病的发生研究颇多，高半胱氨酸血症是导致血管内皮损伤、动脉 粥样硬化、血栓形成的一个危险因素。肺栓塞是静脉血栓形成常见而严重的并发 症，因此，高半胱氨酸血症可能增加肺栓塞发生的危险，目前国内外研究推测二 者之间可能存在相关性，但报道主要集中在临床病人，尤其是已经发生了肺栓塞 的病人，研究方法为回顾性研究，对于病人未发生肺栓塞之前的体内半胱氨酸的 含量不明确，许多生理
12、性、获得性和药物等因素都能影响半胱氨酸水平。 本研究首先建立高半胱氨酸血症动物模型，在高半胱氨酸血症模型的基础上 通过给实验兔注入自体血栓制备肺血栓栓塞症动物模型，肺栓塞模型成功后通过 血清学及病理学检查，探讨二者之间可能存在的相关性。 第 3 章 材料与方法 7 第3章 材料与方法 第3章 材料与方法 3.1 实验材料实验材料 实验动物 实验动物 本实验动物由由河南科技大学实验动物房提供，新西兰大耳白兔 30 只，体 重 2.02.5kg ，实验兔购入后饲养于河南科技大学医学院实验动物房。喂养条 件：屏障环境，室内温度 2025，湿度 40%70%，分笼饲养，光暗按昼夜变 化，供标准饲料（购
13、自河南科技大学实验动物房）和大白菜，自由饮食。饲养期 间，我们严格遵守实验动物伦理道德法则，给予相同的饲料和饲养条件，并保证 所有实验动物享有应有的权利。 实验用品 实验用品 蛋氨酸 武汉远城科技发展集团（批号 08035） 麻醉剂： 3%戊巴比妥钠溶液(蒸馏水自行配置) 肺灌注显像剂 99mTc-聚合白蛋白（MMA）185-370MBq 蛋氨酸饲料的配制： 草粉 20% 玉米 20% 大豆 10% 面粉 18% 蛋氨酸 2% 麸子 30%（有河南科技大学动物房提供） 主要试剂盒 主要试剂盒 D-二聚体试剂盒 上海西塘生物科技有限公司 脂蛋白（a）试剂盒 中生北控生物科技股份有限公司 一氧化氮
14、（NO）测定试剂盒 南京建成生物工程研究所 内皮素（ET）放射免疫药盒 北京科美东雅生物技术有限公司 主要仪器设备 名称 型号 生产厂家 电脑程控组织脱水机 LEICA-TP1020 德国莱卡公司 电脑程控组织包埋机 PPDB-21C 襄樊徕克生物电子仪器厂 电脑程控烘片机 PPTHK-21B 襄樊徕克生物电子仪器厂 轮转式切片机 LEICA RM2235 德国 LEICA 公司 河南科技大学硕士学位论文 8 -20冰柜 TC-331 SANYO 公司 微量移液器 CYY14 Labsystem 公司 水浴箱 ZZ17-20L 北京西城区医疗器械厂 半胱氨酸检测机 ADVIA Centaur
15、西门子 ADVIA Centaur 光学显微镜及照像系统 OLYMPUS BX40 日本 OLYMPUS 公司 病理图像分析系统 KTPA-2006 北京航空航天大学 全自动血气分析仪器 Rapidlab348 拜耳 Bayer 公司 722 分光光度仪 722,721,723 苏州奇乐电子科技有限公司 SPECT SPX-6 美国 GE 公司 3.2 实验方法实验方法 3.2.1 制备动物模型 3.2.1 制备动物模型 1. 高半胱氨酸血症模型制备4 购入家兔后饲养于河南科技大学医学院实验动物房，分笼饲养，让其适应新 环境，并自由进食饮水。观察两天无异常后，家兔随机分为 2 组，每组 15 只， 喂养前均抽血测半胱氨酸值，求出其 95%的可信区间 12.8114.31umol/L，然 后按表 1 给以饲料喂养造模型。在饲养期间，在固定时间内观察动物的饮水、进 食以及排泄情况。 表 1 家兔的分组和饲养 Tab.1 experimental animal administration group 分 组 (只) 饲料 普通组 (15) 标准饲料 高半胱氨酸血症组 (15) 2%蛋氨酸饲料 以上饲养 8 周后，再次抽
