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1、河北师范大学 硕士学位论文 高山倭蛙皮肤新型多功能抗菌肽的基因克隆、鉴定与功能分析 姓名：翟蕾 申请学位级别：硕士 专业：生态学 指导教师：于海宁 20100406 河北师范大学硕士学位论文 摘 要 I 摘 要 西藏高原蛙，学名高山倭蛙，捕捉于拉萨中国的西藏高原。它们主要生活 在中国和尼泊尔境内，西藏高原东边和南边的亚热带区域是它们的唯一的栖息 地，那里有强烈的紫外线辐射和长时间持续的日光照射。高山倭蛙的生活环境极 为严酷，于是我们对其天生的防御体系，即抗微生物和环境应激的能力进行了研 究。在本研究中，从高山倭蛙的皮肤分泌物中分离纯化出 3 种抗菌肽并进行了特 征分析。编码抗菌肽 cDNA 基
2、因的序列也从高山倭蛙皮肤的 cDNA 文库中得到 了克隆。通过进行结构的分析比对，发现其中两种肽属于 Japonicin-1 家族，分 别命名为Japonicin-1Npa (FLLFPLMCKIQGKC)和Japonicin-1Npb (FVLPLVMCKILRKC) 。 第 三 种 分 离 到 的 肽 命 名 为 Parkerin ， 其 序 列 为 GWANTLKNVAGGLCKITGAA，它与现有的所有两栖类动物的抗菌肽都没有相 似性，是首次报道发现的新家族抗菌肽。本研究对 3 种抗菌肽的许多种功能进行 了检测，如抗微生物活性、抗氧化性、肥大细胞脱颗粒作用（MCD）、溶血活 性等等。研
3、究发现，Parkerin 对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及真菌都有抗性， 具有广泛的抗菌活性，并且具有较强的抗氧化活性。Japonicin-1Npa 和 Japonicin-1Npb 抗菌谱较窄，仅对革兰氏阳性菌有较强的抗性，并且只能清除少 部分的自由基。另外，3 条抗菌肽都仅有极其微弱的溶血活性，却全部都有促使 肥大细胞脱颗粒的活性。本实验还使用圆二色光谱（CD 谱）对它们的溶液结构 进行了检测，并通过扫描电镜（SEM）观察发现，3 条抗菌肽的抑菌机制与其功 能特征相一致。本研究工作的结果显示，这些新发现的多功能抗菌肽在保护高山 倭蛙抵抗环境中氧化应激和病原微生物的过程中起到了很大的作用，
4、同时也揭示 了这些高原两栖类动物生态适应性的部分原因。 关键词关键词：两栖类动物，抗菌肽，Japonicin-1Npa (b)，Parkerin 抗氧化剂，高 山倭蛙 河北师范大学硕士学位论文 Abstract II Abstract plateau frog (Nanorana parkeri) captured in Lhasa, Tibet, China, is mainly found in China and Nepal. Its sole habitat is the eastern and southern Tibet plateau in subtropical zone, w
5、here there is strong ultraviolet radiation and long duration of sunshine. Considering its harsh living environment, the frogs innate defense against microbes and environmental stress was investigated. In current study, three antimicrobial peptides (AMPs) were purified and characterized from the skin
6、 secretion of N. parkeri. The coding cDNA sequences were also cloned from the skin cDNA library of N. parkeri. By structural characterization, two peptides were identified belonging to Japonicin-1 family, and named as Japonicin-1Npa (FLLFPLMCKIQGKC) and Japonicin-1Npb (FVLPLVMCKILRKC). The third pep
7、tide isolated named Parkerin with a unique sequence of GWANTLKNVAGGLCKITGAA did not show similarity to any known amphibian AMPs. Parkerin is a brand new amphibian AMP family, and firstly reported here. Multi-functions of three AMPs were examined (antimicrobial, antioxidant, MCD, hemolytic etc). Park
8、erin was the only one showing broad-spectrum antimicrobial activity against Gram -positive, Gram-negative bacteria and fungus, and has stronger antioxidant activity. Both japonicin-1NPa and japonicin-1NPb have relatively narrow range of their antimicrobial list, therefore, only have resistance for G
9、ram-positive bacteria, moreover, only a limited part of free radicals can be eliminated. Otherwise, Three AMPs all had very little hemolytic activity on blood cells. And they were showing to promote mast cell degranulation. Their solution structures determined by CD and antimicrobial mechanisms inve
10、stigated by SEM are very well consistent with their functional characters. Current result suggests that these novel multi-functional AMPs could play an important role in defending N. parkeri against environmental oxidative stress and pathogenic microorganisms, which may partially reveal the ecologic
11、al adaptation of these plateau-living amphibians. 河北师范大学硕士学位论文 Abstract III Key words：Amphibian，Antimicrobial peptide (AMP)，Japonicin-1Npa (b)， Parkerin antioxidant，Nanorana parkeri 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文高山倭蛙皮肤新型多功能抗菌肽的基因克隆、鉴定 与功能分析 ，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的原创性成果。除 文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已
12、经发表或撰写 过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者（签名） ： 指导教师确认（签名） ： 年 月 日 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构 送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在 年解密后适用本授权书） 论文作者（签名） ： 指导教师（签名） ： 年 月 日 年 月 日 河北师范
13、大学硕士学位论文 文献综述 1 文献综述 1 抗菌肽的研究目的与意义 抗生素类药物的出现让人类有了抵御病菌的能力。然而，由于人类对抗生素 类药物的过于依赖和肆意滥用，使得耐抗生素的微生物种类增多，很多曾经高度 有效的药物失效。长期发展下去，人类在面对一些疾病时将会出现无药可医的状 况。抗菌肽的出现让人类在应对后抗生素时代的来临时看到了新的希望。 抗菌肽和微生物产生的多肽类抗生素的区别在于： （1）合成方式不同，抗菌 肽是通过核糖体合成，后者是在肽合成酶的情况下通过非核糖体合成； （2）抗菌 谱不同，前者对耐药性细菌有杀灭作用，有广谱抗菌性，而后者只有抗细菌的作 用； （3）作用方式不同，抗菌肽
14、利用其自身的螺旋结构作用在微生物的细胞膜上 形成孔道， 使得细胞内物质往外泄漏， 导致其电化学势丧失， 进而使靶细胞死亡； 后者则通过抑制细菌的细胞壁合成、 核酸合成、 蛋白质合成等多种方式使其灭亡， 因此较为容易诱发细菌的耐药性产生。 抗菌肽是生物体的免疫系统在对抗外源性病原体的攻击时产生的一种防御 性的多肽活性物质，它的氨基酸数目小于 100，具有广谱抗菌性，同时也是生物 体先天免疫系统的重要组成部分。抗菌肽还具有免疫原性弱、分子量小、稳定性 好 、抗菌效果显著、以及不易产生药物残留等优点1。并且抗菌肽仅作用于发 生病变的真核细胞和原核细胞，对正常的真核细胞几乎没有作用。 抗菌肽独特的抗菌
15、机制为人类战胜耐药微生物提供了新的方向， 因此开发研 究抗菌肽类药物具有重大意义。目前已有部分抗菌肽药品在临床上得到了应用， 相信随着研究的不断深入，将有更多的抗菌肽药品造福人类。 2 抗菌肽的研究进展 2.1 抗菌肽的分类抗菌肽的分类 1981 年,瑞典科学家 G. Boman 等在Nature杂志上公布了世界上第一种抗 菌肽，命名为天蚕素（cecropin） ，这种有抗菌活性的碱性多肽物质是他们利用大 肠杆菌诱导惜古比天蚕( Hyatophra cecropia)蛹分离得到的2。随后，人们相继从 河北师范大学硕士学位论文 文献综述 2 植物、微生物、软体动物、昆虫、鱼类、两栖动物、鸟类、哺乳动物等多种生物 体内陆续发现并分离得到 2000 多种抗菌肽3，并且，已经以天然抗菌肽为模板 人工合成了数千种模拟肽。虽然几乎所有抗菌肽都具有一些本质上的共性4，例 如一般由12至50个氨基酸组成,分子量小于2530 KD ,绝大多数都是阳离子型, 其等电点大于 7 等等。 但是由于其氨基酸序列各式各样， 二级结构也是各有千秋， 因此，对抗菌肽的分类方式也难以统一。 2.1.1 依据抗菌肽结构进行分类 2.1.1.1 依据抗菌肽一级结构分类 （1）不含有半胱氨酸的线性抗菌肽，次类抗菌肽的序列很保守，同源性较 高，
