《骨髓内皮祖细胞和间充质干细胞对动脉粥样硬化血管内皮的修复作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓内皮祖细胞和间充质干细胞对动脉粥样硬化血管内皮的修复作用（87页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中南大学 博士学位论文 骨髓内皮祖细胞和间充质干细胞对动脉粥样硬化血管内皮的修 复作用 姓名：王先酉 申请学位级别：博士 专业：生理学 指导教师：谭孟群 20091101 摘要 心血管系统疾病是现代社会严重威胁人类健康，引起死亡的主要 疾病。动脉粥样硬化( A S ) 是心血管疾病的主要病因之一，阻止A S 的 进展己成为基础医学和临床医学研究的热点。许多心血管疾病发生的 危险因素，如老年、吸烟、糖尿病、高血压、高脂血症等都会造成以 内皮细胞合成一氧化氮C N O ) 能力下降，细胞膜结构发生改变为主要特 点的血管内皮功能失调，血管内皮功能失调是A S 发生的第一步。A S 治疗应包括早期阻止
2、内皮功能失调、内皮细胞凋亡、防止A S 斑块进 展。如何对损伤的内皮进行修复，已成为A S 研究的重点内容。 研究表明内皮祖细胞( E P C ) 具有修复和替代损伤血管内皮细胞 的功能。将体外培养的E P C 输入血管受损的大鼠体内，能促进内皮再 生；生理条件下，轻微受损的血管内皮细胞可以通过邻近细胞的增殖 得到修复，而强烈的氧化应激反应导致的内膜损伤则要通过循环中 E P C 归巢到损伤部位来修复。 研究发现，在成体外周组织，包括某些正常及损伤血管壁附近均 存在一类具有骨髓间充质干细胞特征的细胞，这些细胞可能参与了血 管组织更新和损伤后的修复过程。离体研究证实骨髓M S C 在一定条 件下
3、可分化为E C s ，分化后的M S C 表达E C s 特有标志，如血管内皮 细胞生长因子受体2 ( K D R ) 、血管内皮细胞生长因子受体l ( F l k 1 ) 及血 管细胞黏附分子( V C A M 1 ) 等；此外间充质干细胞可能分泌多种细胞 因子，为受损血管的修复和新血管的生成提供了适当的微环境。 本研究旨在建立高脂饮食导致的动脉粥样硬化模型，研究大鼠骨 髓来源的E P C 和M S C 对动脉粥样硬化的治疗作用，比较两者的治 疗效果，寻找A S 细胞治疗的有效方法。 第一章骨髓E P 0 和l t l S 0 的分离培养、鉴定 目的 分离培养大鼠骨髓E P C 和M S C
4、 ，研究其生物学特性。 方法 1 、无菌条件下取大鼠股骨，冲出骨髓细胞，用大鼠淋巴细胞分 离液分离出单个核细胞，将其重悬在M S C 培养液中培养，检测其生物 学特性( 流式和免疫组化分析表面标志、生长特性) 及多向分化潜能 ( 向脂肪细胞、成骨细胞分化) 。 2 、分离大鼠骨髓单个核细胞，将其重悬在内皮细胞培养液中培 养。应用免疫细胞化学检测内皮细胞表面标志( v W F 、C D 3 1 、C D l 4 4 ) ， 通过U E A 1 结合能力、乙酰化低密度脂蛋白( D i l A c L D L ) 摄取能力的 检测鉴定培养的内皮祖细胞，并研究细胞的生长特性和克隆形成能 力。 弘f 甲
5、 耋口木 1 、骨髓M S C 的生物学特性：第三代贴壁细胞均表达M S C 表面标 志物C D 2 9 ，C D 9 0 ，不表达C D 3 4 、C D 4 5 造血细胞表面标志和C D 3 1 、 v W F 内皮细胞表面标志。第三代M S C 接种后第1 2 天生长较缓慢， 从第3 天起细胞开始增殖并进入对数生长期，细胞迅速增殖。根据 公式D T - - t x l 9 2 ( 1 9 N t - 1 9 N 0 ) ，得出M S C 倍增时间4 9 1 3 + 0 7 h 。 2 、培养的骨髓间充质干细胞在特定的培养条件下具有向脂肪细 胞、成骨细胞分化的能力，符合骨髓间充质干细胞判断
6、的金标准。 3 、培养的E P Cv W F 、C D 3 1 、C D l 4 4 表达阳性，具有与U E A 1 结 合能力和摄取D i I A C L D L 的能力。E P C 的生长特性为：接种后第l 6 d 为潜伏期，从第6d 起细胞开始增殖并进入对数生长期。不同传代 次数之间的E P C 其增值能力存在差异，P 2 代细胞增殖能力强于P 5 代， 它们的增殖能力在第8 天显示出差异( p 6 ，0 0 0 Xg 离心5m i n 收集质粒D N A 。 1 3 1 52 9 3 细胞的传代培养 1 细胞长到8 0 9 6 融合时传代，平均2 - 3 天传代一次； 2 取传代前细胞
7、培养瓶，轻弃培养液； 3 加入适量胰酶溶液，使细胞都浸入溶液中； 4 拧紧瓶盖，放在倒置镜下观察细胞。3 0 s - 6 0 s 原贴壁的细胞逐渐趋于圆 形，加入2 - 3 倍胰酶溶液体积的完全培养液终止消化。 5 用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，加入完全培养基，置3 7 下继续培养。 第二天观察贴壁生长情况。 1 3 1 6r A A V 2 - I R E S - G F P 包装 将培养的2 9 3 细胞由培养瓶转入1 0 c m 的培养皿中，细胞培养2 4 h 左右达到 8 5 一9 0 融合，采用磷酸钙共转染三种质粒。转染前1 - 4 h 细胞换液。转染液 3 m 1 皿。3 0 m
8、l 转染混合液的包括以下组分： p A A V 2 - I R E S - G F P 10ug m l p R C 1 0ug 皿 p H e l p e r 1 0ug n n 1 5 m o l L C a C l 2 2 m l 加灭菌双蒸水至 1 5 m l B u f f e rA1 5 m l 充分混匀，静置8 m i n 。待混合液出现白色云雾状，开始转染，逐滴均匀地滴 在培养皿中，3 m 1 皿，在1 0 0 倍的显微镜下看到均匀的细小颗粒。培养2 4 h 后换液， 博士学位论文第三章M S C 和E P C 对衰老血管内皮的修复作用 培养6 0 - 7 2 h 左右，荧光显
9、微镜下观察的绿色荧光的表达。 1 3 1 7r A A V 2 - I R E S - G F P 纯化 转染后2 9 3 细胞6 0 h 左右，可用细胞刮将细胞从培养皿上刮下，室温离心 3 0 0 0 r p m 、l O m i n ，弃上清，加入P B S ( p H 7 4 ) 重悬( 3 0 m l 1 2 0 皿) ，将细胞放入 - 8 0 低温冰箱保存。 本实验采用S S C P 法纯化病毒，方法如下： 1 将细胞从- 8 0 “ C 低温冰箱中取出，反复冻融3 次后加P B S ( p H 7 4 ) 至5 0m l ， 并加入D N a s e I 和R N a s e A
10、。 2 3 7 水浴3 0 m i n ，离心3 0 0 0r p m ，3 0 m i n ，移上清于新的5 0 m l 离心管中， 加入脱氧胆酸0 2 5 9 。 3 3 7 。C 水浴3 0 m i n ，离心3 0 0 0r p m ，3 0 m i n 。移上清于新的5 0 m l 离心中，分 。， 别用5um 和1 21 1m 滤器过滤，获得病毒粗提液。 4 将病毒粗提液加入准备好的肝素一琼脂糖柱过柱。用2 5 m l0 1 5m o l L 删a C l J 洗柱两次，然后用1 5 m l0 4m o l LN a C l 洗脱病毒。 5 将洗下的病毒液移至A m i c o n
11、U l t r a - 1 5 ( 1 0 0 ，0 0 0 M W ) 超滤离心管 ( M I L L I P O R E ) 离心4 0 0 0r p m ，2 0 m i n ，将病毒液浓缩。1 2 0 个l O c m 细胞培养皿 共获得病毒液0 2 5 m l 。 1 3 1 8 重组病毒纯度检测 按分子克隆方法灌制S D S - P A G E 蛋白电泳的分离胶和积层胶，分离胶浓 度为1 0 ，积层胶浓度为5 。方法和步骤如下： 1 0 分离胶 1 0m l 四蒸水 4m 1 3 0 丙烯酰胺 3 3m 1 1 5m o l LT r i s ( p H 8 8 )2 5m 1 1
12、0 S D S 0 1m 】 博士学位论文第三章M S C 和E P C 对衰老血管内皮的修复作用 1 0 过硫酸铵O 1m l T E M E D0 0 0 4m l 配5 积层胶 4m l 四蒸水 2 7 5 m l 3 0 丙烯酰胺 O 6 7m l 1 0m o l LT r i s ( p H 6 8 ) 0 5m l 1 0 S D S0 0 4m l 1 0 过硫酸铵 0 0 4m 1 T E M E D0 0 0 4m l 混匀后灌胶，插入梳子，4 0m i n 后待胶凝固，拔出梳子。取从V G F P l O u l ， 加入5 x S D S 凝胶加样缓冲液2 u l ，放
13、入沸水中加热5 m i n ，以使蛋白质变性。取 l O u l 加到一个齿孔中在lX T r i s 一甘氨酸缓冲液( 9 0 0m l 蒸馏水，1 5 1gT r i s ， 9 4g 甘氨酸，5 0m L1 0 S D S ，加水至1 0 0 0m 1 ) 中室温1 0 0V ，电泳2 3h 。电 泳完成后，卸下凝胶，切角做标记。对凝胶进行银盐染色，方法和步骤如下： 1 将凝胶浸泡在至少5 倍体积的固定液( 3 0 m l 乙酸，l O m l 冰醋酸，6 0 m l 水) 中室温下平缓摇动4 1 2 h ，使蛋白固定。 2 弃去固定液，加至少5 倍凝胶体积的3 0 乙醇，将凝胶于室温下
14、保温并平 缓摇动3 0 m i n 。 3 重复第2 步。 4 弃去乙醇，加1 0 倍凝胶体积的去离子水，将凝胶于室温下保温并平缓摇 动l O m i n 。 5 重复第4 步两次。 6 弃去最后清洗用的水，戴手套加入5 倍凝胶体积的硝酸银溶液( 0 2 5 m l 的2 0 A g N 0 3 ，5 0 m l 去离子水) 将凝胶于室温下保温并平缓摇动3 0 m i n 。 7 弃去硝酸银溶液，用去离子水流漂洗凝胶两面。 8 加5 倍凝胶体积的新鲜显影液( 2 5 9 碳酸钠，0 0 2 m L 甲醛，l O O m l 去离 子水) ，将凝胶于室温下保温并轻柔搅动，仔细观察凝胶的变化，在数
15、m i n 内会 3 5 博士学位论文 第三章M S C 和E P C 对衰老血管内皮的修复作用 出现蛋白质的染色条带，继续保温直至达到所需的对比度。 9 用l 乙酸洗涤凝胶表面数分钟后终止反应，再用去离子水漂洗数次，每 次l O s ，照相。 1 3 1 9 重组病毒滴度检测( 斑点杂交) 1 地高辛标记探针的制各 模板：A A V I R E S - G F P 质粒 I R E S 引物： 匕游57 A A G G A T T A C A A A G A C G A C G - - 3 7 ：游57 G G T T G T G G C C A T T A T C A 一3 7 体系：T
16、a k a r aE x T a q 0 1I l1 l O E x T a qb u f f e r 2 5 Ul ? ， A A V I R E S G F P 质粒 2u1 D I G H I G HP r i m e r2U1 引物 1pl 四蒸水1 7 4u1 在B O A R Dm y c y c l e 型P C R 扩增仪上完成P C R 扩增，条件如下：9 4 预变性 4 m i n ，9 4 4 5 s e c ，5 2 4 5 s e c ，7 2 l m i n ，完成3 5 个循环，7 2 l O m i n ，4 保温。 P C R 反应结束后，取5u1 用琼脂糖电泳检测P C R 扩增效果，看到约为9 0 0 b p 的 条带。 2 样品的处理 取1 0u1 待检r A A V 样品
