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1、华中科技大学 硕士学位论文 骨组织工程用纳米羟基磷灰石/型胶原/壳聚糖复合支架材料 的制备与优化 姓名：章文苑 申请学位级别：硕士 专业：生物材料与组织工程 指导教师：张胜民;原芸 20090522 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 I 摘 要 天然骨组织可认为是由型胶原和低结晶度的羟基磷灰石组成的复合体，选择 型胶原和羟基磷灰石作为骨修复材料能实现对天然骨的仿生。壳聚糖易于与胶原 混合，且二者的在分子层次上的相互作用能使二者的复合体比任一单组份更稳定。 但由于胶原与壳聚糖的力学性能较差，胶原溶胀度高，羟基磷灰石脆性较大，与有 机相结合不紧密等原因导致该类材料溶胀度高，降解过快，
2、限制了该类材料在骨组 织工程中的使用。 本文采用原位合成法代替传统的直接分散法，以胶原和壳聚糖为模板原位合成 羟基磷灰石，再用冷冻干燥法使成型制成多孔材料。这样制备的材料中羟基磷灰石 结晶度更小，表面能大，与有机物基底结合紧密，也能为成骨细胞的粘附提供更多 的活性位点。用 0.2%的戊二醛对材料进行低温浸泡交联，可大幅降低材料的溶胀度 并减缓降解速率。用紫外辐照对材料进行处理，能使其抗压性能得到提高。 经过上述对制备工艺的优化后，用环境扫描电镜(SEM)、红外吸收光谱分析 （FTIR） 、X 射线衍射(XRD)、孔隙率测定、热重分析(TGA)等方法对材料进行表征。 材料与成骨细胞共培养后，用
3、MTT计数和碱性磷酸酶（ALP）活性测定来评价材料 的生物相容性。所得的材料孔隙率超过 92%，孔的连通性好，溶胀度低，降解 12 周 质量损失减小到 16%，其降解速率可与新骨生长速率相匹配，材料的生物相容性良 好，能促进成骨细胞增殖并分泌碱性磷酸酶。该材料是骨组织工程的理想材料。 本文的研究提供了一套制备 nano- HA/COL/CS 复合支架材料的方法和工艺，可 重复性高，为设计和制备理想骨组织工程修复材料的提供了新思路。 关键词：骨组织工程，羟基磷灰石，型胶原，壳聚糖，原位合成 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 II Abstract Hydroxyapatite (H
4、A) and typecollagen are the major constituents of human bone tissue. Collagen (COL) has great biocompatibility while HA is osteoconductive and nontoxic. Chitosan (CS), a polysaccharide and natural polymer, is the partially deacetylated form of chitin that can be mixed well with collagen solution. Th
5、e interaction on molecular level of collagen and chitosan gives good influence of the physicochemical characteristics of collagen. Nano- HA/COL/CS composite scaffolds are supposed to be significant on bone tissue engineering. However, this kind of composites has high swelling degree, poor mechanical
6、 strength and fast degradation. Due to the shortcomings mentioned, the application of this kind of materials on repair bone defects is limited. In this paper, an in situ synthesis method was applied in fabricating the nano- HA/COL /CS scaffolds in stead of mixing HA powder with COL/CS solution, and
7、then a freeze- drying method was used to fabricate porous scaffolds. It was easier to get a homogeneous mixture of two solution systems than of solid powder and solution. The better surface energy of apatite leads a better stability of the scaffold. Then scaffolds were treated by 0.20% glutaraldehyd
8、e (GA) and irradiated by UV to lower their swelling degree and enhance the mechanical strength. After the optional design of technique, the scaffolds we obtained were characterized by scanning electron microscopy (SEM); Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR) and X- ray diffraction (XRD), p
9、orosity measurement and thermo gravimetric analysis (TGA) and degrading in vitro. The biocompatibility of the composite scaffolds was evaluated by using methylthiazol tetrazolium (MTT) assay and ALP activity test after cell- materials co- culture osteoblast. The nano- HA/COL/CS composite scaffolds w
10、e designed showed good porosity and biocompatibility, which could encourage osteoblast proliferate and excrete ALP. After 12 weeks degrading, the weight loss of the scaffold was about 16%. The results indicate that the porous nano- HA/COL/CS composite scaffolds are promising materials in tissue engi
11、neering research. The experiments described in this paper are repeatable. This research offers a procedure to prepare this kind of inorganic- organic composite scaffolds Key Words: bone tissue engineering, hydroxyapatite, typecollagen, chitosan, in situ synthesis IV 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研
12、究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不 包含任何其他人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许 论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。 保密，在_年解密后
13、适用本授权书。 本论文属于 不保密 。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 1 绪论 1.1 前言 人体骨具有再生和自我修复能力。由于创伤、感染、肿瘤、先天畸形等原因使 骨丧失了较多的骨质，造成了较大的骨缺损，就需要借助外科手术的方法进行治疗。 较小的骨缺损可用骨水泥来加速其愈合，较大的缺损常需要进行移植手术1。目前， 用于解决骨组织修复和功能重建的方法主要是自体骨移植、同种异体骨移植以及组 织工程化骨移植。自体骨移植取材自患者自身，不会产生免疫排斥反应，至今仍是 组织工程中最
14、常用的方法，但其取材受到限制，并且会造成供体组织的感染，多次 手术更给病人造成很大的痛苦。同种异体骨移植存在免疫排斥反应2。利用组织工程 学原理和方法构建的组织工程骨移植可以改进上述不足，为骨缺损的修复和重建提 供了全新的思路和方法。组织工程支架材料是组织工程的一个核心技术，具有重大 而广泛的研究意义。 本文研究用于骨组织工程的纳米羟基磷灰石/胶原/壳聚糖复合支架材料，并通过 优化制备方式，改善它的力学强度，使之能满足骨组织工程的要求。 1.2 组织工程 组织工程（Tissue engineering）是用生命科学和工程学的原理及技术，体外构建、 培养活体组织，制备组织和器官的替代物，用以修复
15、或重建组织器官，维持或改善 组织器官功能的一门新兴学科3。其基本原理和方法是：将种子细胞在体外培养增殖 后，接种于一种具有良好生物相容性，多数时候要求是一种可降解的多孔材料（支 架材料）上，将细胞- 支架复合物共培养后植入体内缺损部位。细胞在支架材料被降 解吸收的过程中，形成形态和功能与受损部位一致的替代物，从而达到创伤修复和 组织重建的目的。 种子细胞、支架材料、生物活性因子被称为组织工程的三要素。在骨组织工程 中，这三要素分别起骨生成、骨传导和骨诱导的作用。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 组织工程的核心是建立由细胞和支架材料构成的三维空间复合体。三维结构的 支架材料为
16、细胞提供了营养传递、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所,也是形成 新的具有形态和功能的组织、器官的基础。它与传统的二维结构(如细胞培养) 有着 本质的区别。 其最大的优点在于: 能形成具有生命力的活体组织,对缺损组织进行形 态、结构和功能的重建并达到永久性替代； 只需要最少量的细胞（甚至可用组织 穿刺的方法获得)； 经体外培养扩增后,来修复大块的组织缺损,较自体移植有更广泛 的移植体来源； 可按组织的缺损情况来塑型,达到完美的形态修复4。 组织工程的一个独特的方面是研究细胞和支架材料的相互作用。作为细胞粘附 和生长的基底，理想的支架材料应该具有：良好的生物相容性；可降解性和降 解速率的可控性；内部呈多孔性，有较高面积和体积比，连通性好；易有一定 的机械强度及韧性。材料表面有利于细胞的黏附生长，利于细胞的分化6。组织工 程中常用的支架材料有合成高分子材料、天然衍生物材料、生物陶瓷材料，复合材 料，他们在生物相容性和传导性、机械性能等方面各有所长，制备新材料是当前组 织工程的热点之一。 1.3 组
