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1、密级： 分类号： 学号：墨垒曼Q 2 2 Q Q 鱼Q ! ! 墨曼 中国中医科学院 二oo 六级博士研究生学位论文 骨折三期治则对家兔骨折愈合过程中 F G F 2 m R N A ，T G F I j l m R N A 表达调控 的研究 研究生： 专业： 研究方向： 导师： 高国庆 中西医结合临床 骨折愈合基础与临床 温建民主任医师 中国中医科学院望京医院 2 0 0 9 年4 月北京 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立完成，文中除注明引用 的内容外，不包含任何其他已经发表的科研成果。对本文研究做出重要贡献者，己在文 中以明确的方式表明。本声明的法律责任完全
2、由自己承担。 论文作者签名： 新虢丛氢日期：盏皇：么舻 关于学位论文使用授权的声明 本人完全知道中国中医科学院有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或者向 国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权中国中医 科学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：玉i 园( 主 同期：卫绰丛 目录 中文摘要1 A b s t r a c t 7 主要英汉缩略语仃 文献综述1 8 骨折三期治则对家兔骨折愈合过程中F G F 一2 m R N A ，T G
3、F - 1 3 1 m R N A 表达调控的研究2 8 1 材料与方法2 9 1 1 研究设计类型2 9 1 2 实验条件2 9 1 3 主要仪器2 9 1 4 主要试剂3 0 1 5 实验方法3 0 1 6 制作切片3 2 1 7H E 染色3 2 1 8 原位杂交检查3 3 1 9 结果判定3 4 1 1 0 图像分析3 4 1 11 数据处理3 5 2 实验结果3 5 2 1 在骨折愈合过程中不同时间点病理变化及F G F - 2 m R N A ，T G F 一1 3 1 m R N A 表达定位3 5 2 2 模型组、一期组、阳性药组、三期绁骨折愈合过程中骨干细胞F G F 一2
4、m R N A 表达3 6 2 3 模型组、一期组、阳性药组、三期组骨折愈合过程中骨小梁F G F 2 m R N A 表达3 8 2 4 模型组、一期组、阳性药组、三期组骨折愈合过程中内骨膜F G F - 2 m R N A 表达4 0 2 5 模型组、一期组、阳性药组、三期组骨折愈合过程中外骨膜F G F 2 m R N A 表达4 1 2 6 模型组、一期组、阳性药组、三期组骨折愈合过程中纤维骨痂F G F 一2 m R N A 表达4 3 2 7 模型组、一期组、阳性药组、三期组骨折愈合过程中骨干细胞T G F - 1 3 1 m R N A 表达4 5 2 8 模型组、一期组、阳性药
5、组、三期组骨折愈合过程中骨小梁T G F 一1 3 ，m R N A 表达4 7 9 模型组、一期组、阳性药组、三期组骨折愈合过程中内骨膜T G F - 1 3 1 m R N A 表达4 9 1 0 模型组、一期组、阳性药组、三期组骨折愈合过程中外骨膜T G F - 1 3 1 m R N A 表达5 1 11 模型组、一期组、阳性药组、三期组骨折愈合过程中纤维骨痂T G F - p l m R N A 表达5 3 讨论 5 5 1 骨折三期治则的提出及意义5 5 2 中医骨折三期方基本药物方解5 5 3 中医胃折内治法治疗现状5 6 4 骨折愈合过程中F G F - 2 ，T G F 1
6、3 1 对骨修复的作用5 7 5 骨的各部分组织对F G F 一2 m R N A 。T G F - 1 3 1 m R N A 表达的作用5 8 6 中医骨折三期治则对骨折愈合的作用机制6 3 7 中医骨折分期治疗的必要性6 4 结 念6 5 创新点6 6 2 的 的 乃 乃 献 图 一 介 文 附 简 考 义 谢 者 参 论 致 作 骨折三期治则对 1 研究背景 随着交通运输业的发展，骨折成为临床上的常见病和多发病之一。该病的特点为“年 轻化、复杂化、高度致残化”。骨折己严重的影响着人类的生活质量、威胁着人类的健 康，因而骨折的修复与愈合一直是骨科界研究的热点问题。在促进骨折愈合治疗上，中
7、 医药治疗历史悠久，疗效确切。中医学理论的精髓在于辩证论治，因此中医治疗根据骨 折后症候学特点将骨折分为三期：早期活血化瘀、行气止痛；中期接骨续筋、舒筋活络； 后期补益肝肾、强筋壮骨。该治则即为中医治疗骨折的指导原贝0 。中医骨折三期治则对 于骨折的治疗乃至中医骨科的发展起到了不可估量的作用。 目前，中医骨折三期治则已成为现代中医药治疗骨折的指导原则【l 。2 】，然而对于骨 折三期治则的分子生物学机制研究则很少。中医骨折三期治则仅是基于对前人经验的总 结，尚缺乏实验等方面的科学依据，随着现代分子生物学技术发展，研究骨折三期治则 对骨折愈合的分子生物学机制，对指导骨折治疗，丰富骨伤科学内治法，
8、具有重要意义。 先期实验已经应用大鼠骨折模型进行蛋白质水平研究，并且初步证实了骨折分期治疗的 必要性。从基因水平揭示骨折三期治则的作用机制未见报道。 本次实验已经对骨生长因子V E G F 和B M P 2 ，从x 线评分、免疫组化、原位杂交 等方面证实了骨折三期治疗效果优于其他治疗组。为进一步揭示中医骨折三期治则的分 子生物学机制，应用原位杂交技术检测骨折愈合过程中F G F - 2 m R N A ，T G F - p I m R N A 基 因转录水平。研究其分布及表达规律及时间相，从现代医学的角度揭示中医骨折三期治 则的科学性，指导骨折的临床治疗，推动中医骨科治疗的快速发展。 2 材料
9、与方法 2 1 实验动物与骨折模型 中国中医科学院2 0 0 6 级博J j 研究生毕业论文 选用新西兰家兔，健康，雄性，体重2 + 0 5k g ：在桡骨中下段l 3 处，造成3 m m 完全横断骨折。 2 2 随机分组 将1 4 0 只家兔随机分为四组，每组3 5 只，分别为三期组( 中药三期治疗组) 、一 期组( 中药一期治疗组) 、模型组( 模型对照组) 和阳性药组( 阳性药物对照组) 。三 期组、一期组与阳性药组三组文中统称中药组。每个小组再随机分为7 个小组，每组5 只。 2 3 干预方法 将中药制成含生药5 9 m l - 1 的浓缩口服液，灭菌后装瓶冷藏备用。分早晚2 次，灌胃
10、。 根据量效反应确定实验最佳用药剂量为2 倍等效剂量。根据骨折愈合分期方法与家兔骨 折局部组织学变化，将家兔骨折愈合过程分为三期：早期即术后1 7 天；中期即术后8 2 8 天；后期即术后2 9 5 6 天。 三期组根据“中医骨折三期治疗”原则，分三期治疗：早期活血化瘀、行气止痛，选 用加减肢伤一方；中期接骨续筋、舒筋活络，选用加减肢伤二方；后期补益肝肾、强筋 壮骨，选用加减肢伤三方。一期组将骨折的早期、中期与后期合并为一期，活血化瘀、 行气止痛、接骨续筋、补益肝肾、强筋壮骨，选用肢伤一方、二方与三方加减方。阳性 药组全程给骨折挫伤胶囊水溶液。模型组给予和实验组等量的蒸馏水灌胃，每同2 次。
11、2 4 标本处理 术后第3 、6 、9 、1 4 、2 8 、4 2 、5 6 天每组随机抽取一小组家兔用空气栓塞法处死， 取左侧桡骨标本为观察对象，将标本固定、脱钙。 2 5 原位杂交 检测骨折标本F G F - 2 m R N A ，T G F - I B l m R N A 。 2 6 图像及数据分析 对骨折端骨干细胞、骨小梁、内骨膜、外骨膜、纤维骨痂组织各取两个高倍镜视野， 对阳性表达细胞进行M O D 值测定。用S P S S l 3 0 统计分析软件进行统计分析。 3 结果 2 。_-_-_。一 中国中医科学院2 0 0 6 级博- f 研究生毕业论文 - _ _ _ _ _ _
12、_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ I _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ 一 3
13、1 模型组、一期组、阳性药组与三期组骨折愈合过程中F G F - 2 m R N A 表达M O D 值变 化 3 1 1 各组骨干细胞F G F - 2 m R N A 表达 各组间M O D 值的比较显示：术后1 4 天：阳性药组显著高于模型组，p O 0 5 。 三期组有高于模型组的趋势，p O 0 5 。术后6 2 8 天：三期组有高于模型组的趋势， p O 0 5 。 3 2 5 各组纤维骨痂T G F - l i lm R N A 表达 各组问M O D 值的比较显示：术后1 4 天：阳性药组极显著高于模型组，p 0 0 5 。术后3 天：组 间无差异。术后6 2 8 天：三期组有高于模型组的趋势，p
