聚合酶链反应.

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1、第七章 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction ,PCR) DNA的复制 (replication) 由亲代DNA合成两个相同的子代 DNA的过 程。 复制 亲代DNA 子代DNA 一、PCR的基本原理 A G A A C T T T C T T G A A A G A A C T T T C T T G A A T C T T G A A A G A A C T T 母代DNA 子代DNA 基本原理： 在模板、引物、4种dNTP和赖热 DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位 于两段已知序列之间的DNA区段的酶促 合成反应。 基本步骤： 变性：加热使双链DNA变为单链

2、 退火：降温使引物和互补模板在局部 形成杂交链 延伸：耐热DNA聚合酶按53方向 催化以引物为起始点的延伸反应 一、PCR的基本原理 示意图 二、PCR引物设计 PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设 计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。 其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特 异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。 PCR反应中有两条引物，即5引物和3引物。设计引物 时，通常以信息链为基准，5引物与位于待扩增片段5上 游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板， 引导信息链的合成，3引物与扩增片段3端的一小段DNA 序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩

3、增的就是这 一对引物之间的DNA片段。 （一）PCR引物设计原则 1、引物长度一般为1530个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性 降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚 合酶的最适温度74,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加 。 2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现 象。尤其是引物的3端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在模板 的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在4555%左右。 设计引物时要考虑3端和5端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C ）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54C 3、引物自身内部不应存在互

4、补序列以避免折叠成发夹结构。按经 验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。 4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠 。 5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3末端 连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特 异性扩增。 6、引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。 引物3端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳 定。 7、引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生 物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子， 终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5端游离的碱基并不影

5、响 引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始 模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与 的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。 （二）引物设计的方法 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序 列到特定网页，(在线引物设计的网站有： http:/cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3www.cgi; http:/genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer; http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/cg

6、i-bin/primer/primer3.cgi; http:/itsa.ucsf.edu/urolab/methprimer/index1.html; http:/alces.med.umn.edu/rawprimer.html)得到设计好的引物，也可 以在本地计算机上运行引物设计专业软件。软件的引物设计功能主要体 现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件 能够做到，其中以“Oligo 6”最为优秀；其次是引物的自动搜索功能，各 种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。 。 三、模板制备 PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首

7、先 要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。大多数用途的PCR反 应中，对DNA模板的要求并不严格。首先对纯度要求不严。大量的实验数据 表明存在一定量的蛋白质，或SDS等对实验过程影响不大，所以只要没有交 叉污染，模板DNA的制备可以不必像克隆、酶切、连接、标记等反应所用 DNA制备那样严格。其次，模板用量很低，理论上102104拷贝的模板是可满 足各种要求的PCR反应。由于种种原因，准备的模板量要求达一定水平。一 方面可减少由于实验操作和实验精确度方面等原因而引起的扩增失败，同时 用作扩增的模板DNA量越多，由于交叉污染引起的反应失败的可能性小。 （一）DNA模板制备 去垢剂破

8、坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸 水煮沸溶解细胞 要求并不严格 模板用量低，哺乳动物基因组DNA1g，质 粒DNA0.1ng (二)RNA模板的制备 RNA提取试剂盒 酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法 异硫胍氯化铯密度梯度分离法 SDS-酚-氯仿法 注意防止RNA水解 （三）模板的取材 病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、 立克次体、支原体等 病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等 法医学标本：血斑、精斑、毛发 考古标本 四、PCR基本反应 （一）以DNA为模板的反应 反应体积：50100l 缓冲液 引物 底物：4种dNTP 模板：102105拷贝 TaqDNA聚合酶 矿物油 其中模板DNA的用量必须根

9、据其分子量的大小加以调 整。 （二）以mRNA为模板的反应 以mRNA为原始模板进行的PCR 反应称为逆转录PCR 一）逆转录反应体系 体积：20 l 缓冲液 底物：4种dNTP 引物：oligo(dT)1218 模板：RNA 逆转录酶 其他试剂：RNA酶抑制剂， MgCl2.DTT.牛血清白蛋白 二）PCR反应体系同以DNA模 板的反应体系 （三）PCR产物的积累规律 在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理 。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物 逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶 的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相 对

10、稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台 期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增 效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因 素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上 PCR循环。 多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。 PCR产物的积累规律示意图 五、PCR反应条件的控制 (一) 标准PCR反应流程 1.反应体系：标准PCR反应体积为50100l,其 中含有缓缓冲液，4种底物，引物，DNA模板和 耐热热DNA聚合酶。 2.反应应步骤骤：加入各种试剂试剂 ，950C热变热变 性510 分钟钟，使模板DNA充分变变性，同时时除去蛋白

11、酶 ，氯氯仿对对耐热热DNA聚合酶的影响。然后加入 2UTaqDNA聚合酶，加50l液体石蜡封盖反应应 体系，防止液体挥发挥发 。进进行PCR反应应。但 PE9700仪设计仪设计 了热热盖，不需加液体石蜡。 (二)循环参数数 变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度 和时间。94 ，1min；95 ，30 s ；97 ，15 s ； 退火温度和时间：4555 ，30s1min 延伸温度和时间：72 ，时间因扩增片段的长度而异 ：1kb，1min；34kb,34min 循环次数：2530次，视最初靶分子浓度而定 两步PCR：将退火和延伸温度合并为一个温度，采用二 温式两步PCR (三)

12、PCR反应成分 1.PCR反应的缓冲液：1050mmol/L Tris-Cl 缓冲 液，72 时pH7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含 50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会 抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜 或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。 2.镁离子浓度：1.5mmol/L Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+ 浓度过低， 会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异 性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与 PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。 在PCR反应中，Mg2+的

13、总量应比dNTPs的浓度高。 其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可 与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响Taq DNA 聚合酶的活性。 常用1.5mmol/L 。 3.底物浓度：20200mol/L dNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值 调至7.07.5，分装小管，于-20存放，过多冻融会使dNTP 产生降解。 在PCR反应中，dNTPs浓度在20200mol/L, dNTP浓度 过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实 验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可 提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用时必须 以等摩尔

14、数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。 4.耐热DNA聚合酶：2.55 u 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之 一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow 片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对 热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的 DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) 应用于PCR反 应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。 （1）TaqDNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在7580具有最高的聚合酶活性 。7580每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸， 70时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55时为22 个核苷酸/秒；37和22时分别为1

15、.5个和0.25个核 苷酸/秒。温度超过80时，合成速度明显下降，可 能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。 Taq DNA聚合酶没有35外切酶活性。没有校正功能的 。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1% 0.25%。Taq DNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知 忠实性的DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增产物忠 实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如 Vent和Pfu DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化 dNTP加到DNA的3-OH端。但对4种dNTP聚合到3-未端的 能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此 PCR产物的末端总是带有两个A。我们利用它的这种特性， 在构建T载体时，在反应体系 中只加一种底物，即只加 dTTP。此酶就催化在载体末端加上dT,这种载体即可直接用 来克隆PCR 产物。 （2）Tth DNA聚合酶 在95 0C半衰期为20分钟，具有逆转录酶 活性，可简化RT-PCR。但不具35外切 酶活性，没有校对