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1、 实验三实验三 生物药物含量的测定生物药物含量的测定分光分光 光度法测定多糖的含量光度法测定多糖的含量 实验性质：验证性实验实验性质：验证性实验 学时数：学时数：4 4学时学时 生物制药实验课程生物制药实验课程 实验目的：实验目的： 掌握分光光度法测掌握分光光度法测 定多糖含量的原理定多糖含量的原理 和方法；和方法； 用坐标纸描绘标准用坐标纸描绘标准 曲线和用曲线和用Office Office excelexcel求标准曲线。求标准曲线。 实验原理：实验原理： 随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入, ,多糖的多糖的 研究进展很快研究进展很快.
2、 .目前多糖含量的测定方法尚无统一标准目前多糖含量的测定方法尚无统一标准, ,广泛广泛 应用的是苯酚应用的是苯酚- -硫酸比色法硫酸比色法. .该法具有简单、快速、无需多糖该法具有简单、快速、无需多糖 纯品和贵重仪器等优点纯品和贵重仪器等优点, ,且对水溶性样品和非水溶性样品均且对水溶性样品和非水溶性样品均 可测定可测定. . 原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖 ，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚 起显色反应。生成橙色物质，在波长起显色反应。生成橙色物质，
3、在波长490 nm490 nm处和一定浓度处和一定浓度 范围内，其吸光度范围内，其吸光度A A值与糖浓度值与糖浓度C C呈线性关系，从而可用比呈线性关系，从而可用比 色法测定其含量。色法测定其含量。 实验条件实验条件 试剂与仪器：试剂与仪器： 仪器：移液管（仪器：移液管（1mL1mL，2mL2mL）各）各2 2支，玻支，玻 棒、电子天平，棒、电子天平，10mL10mL量筒，量筒，50mL50mL容量瓶容量瓶 8 8个，分光光度计（个，分光光度计（72007200型）、洗耳球、型）、洗耳球、 烧杯等。烧杯等。 试剂：葡萄糖、试剂：葡萄糖、5%5%苯酚、浓硫酸、蒸馏苯酚、浓硫酸、蒸馏 水。水。 材
4、料：坐标纸、铅笔、橡皮擦。材料：坐标纸、铅笔、橡皮擦。 实验步骤：实验步骤：标准曲线的绘制标准曲线的绘制 精密称取精密称取105105干燥至恒重的无水葡萄糖干燥至恒重的无水葡萄糖l00 mgl00 mg于于100 mL100 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，作为对照品溶容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，作为对照品溶 液。液。( (也可：精密称取也可：精密称取1 1水葡萄糖水葡萄糖0.0551 g0.0551 g于于50 mL50 mL容量瓶中容量瓶中 ，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，作为对照品溶液，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，作为对照品溶液) )此标准此标准 溶液溶液1.0mL1
5、.0mL含葡萄糖含葡萄糖1.0mg1.0mg。 精密量取该溶液精密量取该溶液0.25 mL0.25 mL、0.5 mL0.5 mL、1.0 mL1.0 mL、1.5 mL1.5 mL、2.0 2.0 mLmL、2.5 mL2.5 mL分别置于已编号的分别置于已编号的 50 mL50 mL容量瓶中，加蒸馏水容量瓶中，加蒸馏水 定容，吸取上述溶液各定容，吸取上述溶液各2.0 mL2.0 mL，再加入，再加入5 5苯酚溶液苯酚溶液1.0 mL1.0 mL ，摇匀。迅速加入硫酸，摇匀。迅速加入硫酸5 mL5 mL，摇匀，室温放置，摇匀，室温放置5 min5 min90 90 水浴加热水浴加热15 mi
6、n15 min。冷却至室温；以蒸馏水作参比测定。冷却至室温；以蒸馏水作参比测定 在波长在波长490 nm490 nm处的吸光度，得浓度处的吸光度，得浓度(c)(c)与吸光度与吸光度(A)(A)的线性回的线性回 归方程。归方程。 实验步骤：实验步骤： 目标产物的测定目标产物的测定 精密称取干燥至恒重的芦荟粗多糖精密称取干燥至恒重的芦荟粗多糖2mL2mL于于 50 mL50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。 取取1.0 mL1.0 mL，加入，加入5 5苯酚溶液苯酚溶液2.0 mL2.0 mL，然，然 后按第后按第1.21.2步操作，测定其吸光度。并由标步操作，测定
7、其吸光度。并由标 准曲线方程求出溶液浓度，得出芦荟粗多准曲线方程求出溶液浓度，得出芦荟粗多 糖中的总糖含量。糖中的总糖含量。 思考题思考题 用苯酚用苯酚硫酸比色法测定多糖含量的硫酸比色法测定多糖含量的 原理及注意事项？原理及注意事项？ 分析误差产生的原因？分析误差产生的原因？ 实验报告实验报告 按规范格式写出实验报告（实验顺序、名称、按规范格式写出实验报告（实验顺序、名称、 姓名、学号、实验目的、原理、步骤、实验结姓名、学号、实验目的、原理、步骤、实验结 果与记录、思考题、注意事项）果与记录、思考题、注意事项） 本实验还要求：本实验还要求： 用坐标纸绘出标准曲线；用坐标纸绘出标准曲线； 计算多
8、糖的浓度；计算多糖的浓度； 用用Microsoft ExcelMicrosoft Excel作图，绘曲线及求方程和作图，绘曲线及求方程和r r值值 。 注意事项注意事项 实验过程要特别细心，尽可实验过程要特别细心，尽可 能减小误差。能减小误差。 注意浓硫酸的正确使用。注意浓硫酸的正确使用。 分光光度计的正确使用。分光光度计的正确使用。 苯酚有毒。苯酚及其苯酚有毒。苯酚及其 浓溶液对皮肤有强烈浓溶液对皮肤有强烈 的刺激作用，若不慎的刺激作用，若不慎 将苯酚沾到皮肤上，将苯酚沾到皮肤上， 应用酒精或聚乙二醇应用酒精或聚乙二醇 清洗；若量较大或者清洗；若量较大或者 混有氯仿，则需要进混有氯仿，则需要进 行急救。沾到衣服上行急救。沾到衣服上 也需用大量水冲洗。也需用大量水冲洗。
