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1、中山大学 博士学位论文 霍乱毒素抑制人膀胱癌细胞侵袭的作用及分子机制研究 姓名：欧艳秋 申请学位级别：博士 专业：药理学 指导教师：颜光美 20100608 巾山大学博士学位论文霍乱毒素抑制人膀胱癌细胞侵袭的作用及分子机制研究 霍乱毒素抑制人膀胱癌细胞侵袭的作用 及分子机制研究 专业：药理学 博士研究生：欧艳秋 导师：颜光美教授 摘要 膀胱癌是人类泌尿系最常见的恶性肿瘤。目前，对于侵袭性膀胱癌仍没有有 效的治疗手段，虽然采取手术切除、放疗和化疗的治疗方法，但是患者的预后并 不乐观。而且现在临床常用的复合化疗方案M V A c ( 氨甲蝶呤+ 长春新碱+ 多柔霉 素+ 顺铂) ，对患者的毒性非常
2、大。寻找新的能够抑制膀胱侵袭的药物，是膀胱 癌治疗研究的关键。 完整的细胞骨架是细胞运动和侵袭的先决条件。微管足细胞骨架的重要组成 部分。影响微管稳定性和完整性的药物在低于细胞毒的剂量下就能明显下调细胞 的运动和侵袭能力。本实验室早期研究发现，霍乱毒素可使短梭形，胞突较短的 恶性胶质瘤细胞转变为小胞体，多细丝状突起的正常胶质样细胞。提示，霍乱毒 素可能引起肿瘤细胞的骨架改变。 在本研究中，我们进一步发现霍乱毒素可诱导膀胱癌细胞形态发生类似改 变，并检测到药物导致细胞骨架破坏，侵袭能力明显下降。另外，我们确定了微 管相关蛋白( 姒P 4 ) 是膀胱癌细胞维持微管骨架稳定和侵袭能力的必要因子，而
3、霍乱毒素能明显提高M A P 4 的磷酸化水平。我们推测霍乱毒素通过磷酸化M A P 4 蛋白，使其失去稳定微管的作用，从而使微管骨架破坏和细胞侵袭能力下降。我 们的工作为膀胱癌的侵袭性研究和治疗提供了理论成果，并为临床膀胱癌治疗提 供了新的靶点和药物。 中山大学博：J ：学位论文霍乱毒素抑制人膀胱癌细胞侵袭的作用及分子机制研究 第一章霍乱毒素对人膀胱癌细胞形态和骨架的影响 实验室前期的工作发现牛物毒素霍乱毒素能诱导恶性胶质瘤细胞形态改变 与分化。进一步研究发现霍乱毒素可诱导膀胱癌细胞形态发生类似改变，并引起 明显的微管和微丝骨架的破坏。 方法：人膀胱移行细胞癌T 2 4 和U M U C 3
4、 细胞株的培养；相差显微镜( p h a s e c o n t r a s tm i c r o s c o p y ) 观察细胞形态，细胞免疫荧光方法和激光共聚焦显微镜观察 细胞骨架的变化；W e s t e r nb l o t t i n g t i n g 法检测微管的聚合和解聚状态以及稳定型 微管蛋白a c e t y l a t e d t u b u l i n 水平；定量实验结果以x _ - L S 表示，采用方差分析检验。 结果：霍乱毒素可以引起人膀胱移行细胞癌T 2 4 和U M U C 3 细胞株出现显 著的形态学变化，激光共聚焦显微镜c o n f o c a i 及
5、w e s t e r nb l o t t i n g 结果显示霍乱毒 素可破坏细胞微管结构和抑制微管聚合，并可被低剂量的紫杉醇预处理逆转； c o n f o c a l 结果同时显示霍乱毒素可破坏细胞微丝结构，推测为微管结构破坏的伴 随变化。 结论：霍乱毒素可诱导膀胱癌细胞形态发生改变，并主要引起微管骨架破坏。 第二章霍乱毒素对人膀胱癌细胞存活和侵袭能力的影响 T r a n s w e l l 小室模型是检测细胞迁移和侵袭能力的最为常用的体外模型。我 们在实验中发现，霍乱毒素对人膀胱癌细胞株的侵袭和迁移能力有明显的抑制作 用。通过排除霍乱毒素对细胞活性的影响或损伤作用，并排除细胞黏附分
6、子和蛋 白酶类的作用，证明霍乱毒素足通过破坏膀胱癌细胞的微管骨架从而抑制细胞的 侵袭和迁移。 方法：永生化的非致瘤人膀胱上皮细胞S V - H U V - I 细胞株的培养；甲基偶氮 唑蓝比色( 3 - ( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z 0 1 2 - y 1 ) - 2 ，5 - d i p h e n y lt e t r a z o l i u mb r o m i d e ，M T T ) 法 检测细胞增殖能力；乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ，L D H ) 法检测细胞毒性； 双醋酸荧光素
7、F D A 染色检测细胞存活情况：T r a n s w e l l 小室法检测侵袭能力；划 痕实验法检测迁移能力；W e s t e r nb l o t t i n g 检测M M P 2 ，M M P 9 ，I n t e g r i n - 1 3 ，E - - c a d h e r i n , u P A 的蛋白水平；E L I S A 试剂盒检测M M P 2 ，M M P 9 的酶活性。定量实验结果以 x + S 表示，采用方差分析检验。 H 中山大学博：I ：学位论文霍乱毒素抑制人膀胱璃细胞侵袭的作用及分子机制研究 结果：霍乱毒素呈时问和剂量依赖性地抑制1 “ 2 4 和U
8、M U C 3 细胞的活性， 但对非致瘤的膀胱上皮细胞细胞无抑制作用。在观察时闻内，霍乱毒素对以上三 种细胞均不引起明显的损伤或凋亡。T r a n s w e l i 小室检测及划痕实验及结果显示 霍乱毒素可抑制人膀胱癌细胞株的迁移及侵袭。霍乱毒素对细胞黏附分子和蛋白 酶类的蛋白水平或活性没有明显影响，推断霍乱毒素通过破坏膀胱癌细胞的微管 骨架从而抑制细胞的侵袭和迁移。 结论：霍乱毒素通过非细胞毒作用，破坏膀胱癌细胞的微管骨架从而抑制细 胞的侵袭和迁移。 第三章霍乱毒素引起人膀胱癌细胞侵袭能力下降和 微管骨架破坏的机制的探讨 霍乱毒素影响骨架的机制虽有报道且多种多样，但对于它在膀胱癌细胞上对
9、 微管骨架的影响还不得而知，而且关于霍乱毒素抑制癌细胞侵袭的机制也尚未见 报道。本章旨在阐明霍乱毒素引起人膀胱癌细胞侵袭能力下降和微管骨架破坏的 机制，寻找直接影响骨架变化和侵袭能力下降的靶标分子。 方法：干扰R N A ( s i R N A ) 技术研究M A P 4 蛋白对维持微管骨架稳定性和侵袭 能力的作用以及c A M P P K A 通路对细胞骨架和侵袭能力的影响；C O I P 和 W e s t e r nb l o t t i n g 法检测霍乱毒素对微管相关蛋白4 ( M A P 4 ) 和促微管解聚蛋白 S t a t h m i n 的影响；P u l l d o w
10、n 方法检测小G 蛋白的活性；定量实验结果以x S 表 示，采用方差分析检验。 结果：F o r s k o l i n 和双丁酰环腺苷酸( d b c A M P ) 等c A M P 水平升高剂具有霍乱 毒素类似的破坏微管和侵袭能力的作用。干扰P K A 的活性后，霍乱毒素的上述 作用被取消。干扰M A P 4 后出现类似于霍乱毒素的作用。霍乱毒素呈P K A 依赖 性引起M A P 4 蛋白磷酸化水平升高，但不影响M A P 4 与S t a t h m i n 的蛋白水平。 霍乱毒素对小G 蛋白R h o 家族的活性无明显影响。 结论：霍乱毒素是通过c A M P P K A 依赖的信
11、号通路磷酸化M A P 4 蛋白，从而 影响细胞骨架和侵袭能力的。M A P 4 是控制细胞骨架和侵袭能力的重要靶分子。 i l l 中山大学博上学位论文霍乱毒素抑制人膀胱癌细胞侵袭的作用及分子机制研究 第四章阿司匹林对胰腺癌细胞增殖和吉西他滨敏感性的 影响及其机制研究 迄今，很多研究表明阿司匹林( 乙酰水杨酸) 对胰腺癌有明显的生长抑制作 用，但是具体的机制还不完全清楚。另外，阿司匹林对肿瘤细胞的耐药性的影响 也是颇受争议的。本章就阿司匹林对胰腺癌细胞增殖和对吉西他滨敏感性的影响 两个问题进行探讨。 方法：人源胰腺癌细胞株P A N C 1 和C a p a n - I 的培养；M T T
12、, L D H ，A n n e x i n - V , H o e c h s t 3 3 2 5 8 检测细胞的活性，凋亡和损伤；流式细胞仪检测细胞周期；特异性 的磷酸化抗体检测某些蛋白的活化形式：R T - P C R 检测C y c l i n D l 和B c l 一2 的转录 情况。 结果：单用阿司匹林呈时效和量效依赖性地抑制胰腺癌细胞的增殖，主要是 通过诱导细胞周期阻滞在G I 期：阿司匹林可以促进吉西他滨对细胞的杀伤作用， 但本身不引起细胞凋亡或者损伤；阿司匹林能够抑制胰腺癌细胞核内G S K 一3 p 的 活性及其下游基因C y c l i n D l 和B c l 2 的转
13、录和表达。 结论：阿司匹林通过抑制胰腺癌细胞核内G S K 3 D 的活性及其下游基因， 以抑制胰腺癌细胞的增殖以及增加吉西他滨的敏感性。 I V 中山大学博士学位论文霍乱毒素抑制人膀胱j i ； 细胞侵袭的作用及分了机制研究 E f f e c t sa n dm e c h a n i s m so fc h o l e r at o x i no nt h e i n v a s i o nc a p a b i l i t yo fb l a d d e rc a r c i n o m ac e l l s M a j o r ：P h a r m a c o l o g y N a
14、 m e ：O uY a n q i u S u p e r v i s o r ：P r o f Y a nG u a n g m e i A B S T R A C T U r i n a r yb l a d d e rc a n c e ri st h em o s tc o m m o nm a l i g n a n c yo ft h eu r i n a r ys y s t e m T h el e t h a l i t yo fb l a d d e rc a n c e ri sm a i n l yd u et om i g r a t i o na n di n v
15、 a s i o n 幻m u s c l ea n d p e r i v e s i c a lt i s s u e s ，w h i c hd i r e c t l yl e a d st od i s t a n tm e t a s t a s i sa n dd e a t hf r o mt h i s d i s e a s e T h e r ei sap r e s s i n gn e e dt o e x p l o r en o v e lt h e r a p e u t i ct a r g e t s f o rt h e m a n a g e m e n
16、 to fi n v a s i v eb l a d d e rc a n c e r M i e r o t u b u l e s ( M T s ) a r ck e yc o m p o n e n t so ft h ec y t o s k e l e t o nw h o s es t r u c t u r a l i n t e g r i t yi sm a n d a t o r yf o rc e l ls t r u c t u r em a i n t e n a n c e ，m o t i l i t y , m i g r a t i o na n di n v a s i o n A g e n t si n t e r f e r i n gw i t ht h ei n t e g r i t yo rd y n a m i ci n s t a b i l i t yo fc a n c e rM T Sc a ni n h i b i t m i g r a t i o na n di n
