雾化吸入三氧化二砷对哮喘豚鼠平喘机制的实验研究

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1、中山大学 硕士学位论文 雾化吸入三氧化二砷对哮喘豚鼠平喘机制的实验研究 姓名：侯红梅 申请学位级别：硕士 专业：内科学 指导教师：张孔 20100525 雾化吸入三氧化二砷对哮喘豚鼠平喘机制的实验研究中山大学硕士学位论文 雾化吸入三氧化二砷对哮喘豚鼠平喘机制 的实验研究 专业：内科学 研究生：侯红梅 导师：张孔教授 中山大学附属第一医院呼吸内科 中文摘要 一、研究背景和目的 支气管哮喘( 简称哮喘) 是由多种细胞( 嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T 细胞、 中性粒细胞、气道上皮细胞等) 和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。这种慢 性炎症导致气道反应性的增加，通常出现广泛多变的可逆性气流受限，并引起反

2、 复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间和( 或) 清晨发作、加剧， 多数患者可自行缓解或经治疗缓解。哮喘是全世界最常见的慢性呼吸道疾病之 一，近年来，其发病率和死亡率逐渐增高，给社会及患者带来沉重的负担。 哮喘是以嗜酸性粒细胞浸润为主的气管炎症，嗜酸性粒细胞增多、聚集和浸 润气道是其主要病理改变之一。研究表明，嗜酸性粒细胞凋亡抑制是影响嗜酸性 粒细胞作用的关键环节。白细胞介素。5 ( I L 一5 ) 作为最重要的嗜酸性粒细胞生成素， 能选择性作用于嗜酸性粒细胞，促进嗜酸性粒细胞在肺泡的聚集，因此通过抑制 I L - 5 产生进而抑制嗜酸性粒细胞在肺内聚集，对治疗哮喘有重要意义，相关

3、研究 表明抗I L 5 可显著加速嗜酸性粒细胞的凋亡。白细胞介素1 0 ( I L 1 0 ) 是一种多 功能、作用强的免疫抑制因子，主要由单核、巨噬细胞、T 细胞、B 细胞产生， I L 1 0 可以抑制多种细胞合成其他细胞因子，因此也称细胞因子合成抑制因子 雾化吸入三氧化二砷对哮喘豚鼠平喘机制的实验研究中山大学硕士学位论文 ( C S t F ) 。在哮喘中其可抑制T h 2 细胞分泌炎症细胞因子。I L 1 2 是调节T h l T h 2 细胞平衡的关键细胞因子之一，I L 1 2 能抑制哮喘气道的高反应性，在哮喘的发 病中起着重要作用。 哮喘的治疗药物上，目前以表面激素应用为代表的抗

4、炎治疗是治疗哮喘的主 要方法，有时也需要全身用药，尤其是激素抵抗型哮喘及激素依赖型哮喘。因此 应用雾化吸入疗法寻找新的有效的药物治疗哮喘，更好的控制哮喘是必要的。 祖国传统的医学治疗哮喘已有悠久的历史，其中砒霜( 主要成分为三氧化二 砷，A r s e m ct r i o x i d e ，A s 2 0 3 ) 就作为平喘主要服用药物早就见之诸多论著，但由 于砒霜的毒副作用，受到应用限制。这些年，已有砒霜的主要提取物三氧化二砷， 随着对哮喘发病机制的进一步研究及雾化吸入疗法的应用，三氧化二砷的平喘作 用重新为人们所认识。目前人们虽然已经观察到三氧化二砷有一定的治疗哮喘的 作用，对其作用机制

5、也有一定的研究，但采用雾化吸入三氧化二砷在哮喘豚鼠中 对白细胞介素5 、白细胞介素1 0 及白细胞介素1 2 的影响的研究较少。 因此，本研究的目的是：观察雾化吸入不同剂量三氧化二砷对哮喘豚鼠嗜酸 性粒细胞、I L 5 、I L 1 0 及I L 1 2 以及形态学的影响，分析I L 5 、I L 1 0 与I L 1 2 的相关性，探讨三氧化二砷治疗哮喘的效果与机制；通过观察雾化吸入不同剂量 三氧化二砷对哮喘豚鼠心、肝、肾形态的影响，判断三氧化二砷可能出现的毒副 作用，进一步探讨用药的安全性。 二、材料与方法 1 实验动物 体重约( 3 0 0 - 1 - 5 0 ) g 的雄性豚鼠5 0

6、只，按照完全随机方法分为以下5 组： 正常对照组( A 组) ，A s 2 0 3 单倍剂量组( B 组) ，A s 2 0 3 双倍剂量组( C 组) ，A s 2 0 3 四倍剂量组( D 组) ，阳性对照组( E 组) 。 2 实验方法 2 1 哮喘动物模型的制备 实验第1 天以生理盐水l m l ，卵白蛋白( O V A ) 1 0 0 m 氢氧化铝( A 1 ( O H ) 3 ) l O O m g 配成致敏液腹腔注射致敏B 组、C 组、D 组、E 组，A 组则仅以生理盐水 I I 雾化吸入三氧化二砷对哮喘豚鼠平喘机制的实验研究 中山大学硕士学位论文 l m l ，A I ( O

7、H ) 3 1 0 0 m g 配成混悬液腹腔注射。实验第1 5 天开始B 组、C 组、D 组、E 组豚鼠雾化吸入I O V A 进行引喘，每天一次，连续8 天。A 组则仅以生 理盐水雾化吸入。 2 2 药物处理 实验第1 6 天开始B 组、C 组、D 组分别以预定不同的雾化剂量于引喘前3 0 m i n 雾化给药，时间1 5 m i n ：A 组、E 组雾化吸入生理盐水。 2 3 收集支气管肺泡灌洗液( B A L F ) 每组随机取8 只豚鼠处死后进行支气管肺泡灌洗，收集B A L F 。将收集的 B A L F 混匀，离心( 2 0 0 0 r p m ，4 “ C ) 1 0 m i

8、n ，上清夜分装于8 0 “ C 冰箱中待测细胞 因子I L 5 、I L 1 0 、I L 1 2 。用E L I S A 法测定上清液中I L 5 、I L 1 0 、I L 1 2 水平， 严格按照试剂盒说明书操作。采用白细胞计数法计数B A L F 中细胞总数。瑞氏染 色后每片计数2 0 0 个有核细胞，计数嗜酸性粒细胞的个数( E O S ) ，获得E O S 的 百分比。 2 4 病理学检查 每组余下2 只实验豚鼠，取肺组织，做H E 染色，观察嗜酸性粒细胞在肺内 浸润的情况及支气管平滑肌和基底膜的改变；同时取心、肝、肾做H E 染色。观 察心、肝、肾组织形态学改变。 3 统计学处

9、理 各组数据以中位数和四分位数表示。采用S P S S1 3 0 统计软件处理，以P O 0 5 ) ；B 组与C 组、D 组比较差异有统计学意义( p O 0 5 ) ；B 组与C 组、D 组比较差异有统计学意义( p O 0 5 ) ；B 组与C 组、D 组比较差异有统计学意义( p o0 5 ) 。( 见表4 及图7 ) 表4 各组豚鼠B A L F 中I L 一1 0 水平f M ( O L ， 注：p O 0 5 ) ；A s 2 0 3 双倍剂量治疗组及A s 2 0 3 四 倍剂量雾化吸入后豚鼠B A L F 中I L _ 5 水平与阳性对照组豚鼠B A L F 中I L _ 5

10、 的水平 比较明显降低，差异有统计学意义( p O 0 5 ) ，表明三氧化二砷对哮喘豚鼠I L - 5 水平的影响随剂量的增加，作用并 没有明显增强，即未呈现明显的量一效关系。 本实验通过相关性分析结果显示豚鼠B A L F 中I L 一5 与E O S 呈正相关，且有统 计学意义，表明I L - 5 与E O S 在肺泡的浸润、聚集等有着密切的联系，本实验显 示三氧化二砷能降低哮喘豚鼠B A L F 中的I L 一5 水平，表现出抗哮喘的活性，提示 通过影响I L 一5 的产生可能是三氧化二砷影响E O S 在肺内浸润的一个环节，但具 体是抑制I L 一5 的转录或是抑制I L 一5 的分

11、泌，是直接作用抑或问接影响等问题尚 需一步探讨。 2 0 雾化吸入三氧化二砷对哮喘豚鼠平喘机制的实验研究中山大学硕士学位论文 三、三氧化二砷对哮喘豚鼠B A L F 中l L 10 的影响 I L - 1 0 是一种多功能、作用强的免疫抑制因子【2 3 1 ，主要由单核、巨噬细胞、 T 细胞、B 细胞产生【2 4 之卯，关于I L 一1 0 在哮喘中的异常表达尚无定论。L e b l o n d 掣6 1 】发现，重度哮喘患者支气管肺泡灌洗液( B A L F ) 中I L - 1 0 高于哮喘稳定期和 正常对照。但更多研究显示，哮喘发作时I L - 1 0 水平降低。K o n i n g

12、等【6 2 】发现过 敏性和非过敏性哮喘患儿与正常对照组比较外周血T 细胞表达I L - 1 0m R N A 都降 低。哮喘治疗后，I L 一1 0 水平普遍升高。特异性免疫治疗后，抗原特异性T 细胞分 泌I L 1 0 和转化生长因子( T G F ) 一B 明显增加，C D 4 + C D 2 5 + T 细胞数目增加，抑制 T 细胞增殖反应和I L q 、I L - 5 、I L - 1 3 分泌，降低对突变原反应性 6 3 1 。I L - 1 0 能明显拮抗过敏性炎症：抑制T 细胞、抗原呈递细胞、自然杀伤细胞释放前炎症 细胞因子I L - I 、I L - 6 、I L - 8 、

13、肿瘤坏死因子( T N F ) 一a 和单核细胞炎性蛋白、单 核细胞趋化蛋白；抑制肥大细胞特异性I g E 交联和脱颗粒释放炎性介质：抑制抗 原特异性I g E 分泌，增加I g G 4 合成，使特异性I g E I g G4 比例明显下降；抑 制T h 0 和T h 2 产生I L - 5 ，阻碍E O S 浸润和活化，促进其凋亡畔】。 本实验结果表明，阳性对照组豚鼠B A L F 中I L - 1 0 的水平较正常对照组显著 降低，表明在哮喘中存在I L - 1 0 水平的减低；实验结果显示：A s 2 0 3 单倍剂量治 疗组雾化吸入后豚鼠B A L F 中I L - 1 0 水平与阳性

14、对照组豚鼠B A L F 中I L - 1 0 的水平 比较有所升高，但差异没有统计学意义( p 0 0 5 ) ；A s 2 0 3 双倍剂量治疗组及A s 2 0 3 四倍剂量雾化吸入后豚鼠B A L F 中I L - 1 0 水平与阳性对照组豚鼠B A L F 中I L - 1 0 的水平比较明显升高，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ，表明三氧化二砷对哮喘豚鼠I L - 1 0 水平的影响随剂量的增加，作用 并没有明显增强，即未呈现明显的量一效关系。 本实验通过相关性分析结果显示豚鼠B A L F 中I L - 1 0 与I L - 5 呈负相关，且有 统计学意义，表明哮喘发病时

15、可能由于I L - 1 0 分泌低下，不能抑制I L 一5 的分泌， 从而使哮喘的气道炎症加重；本实验显示三氧化二砷能升高哮喘豚鼠B A L F 中的 I L 一1 0 水平，表现出抗哮喘的活性，提示对I L - 1 0 的影响也可能是三氧化二砷平 喘机制的一个作用点，但作用的具体环节，促进I L - 1 0 的转录抑或是加速I L 一1 0 2 l 雾化吸入三氧化二砷对哮喘豚鼠平喘机制的实验研究中山大学硕士学位论文 的分泌等问题，是直接作用抑或间接影响，尚需一步的实验探究。 四、三氧化二砷对哮喘豚鼠B A L F 中I L 12 的影响 I L - 1 2 一开始被认为是一种能与I L -

16、2 协同增加细胞毒T 细胞反应的细胞因 子，I L - 1 2 主要由B 淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞这些抗原递呈 产生【6 5 删。在观察过敏性哮喘患者气道活检组织，发现其I L - 1 2 m R N A 的表达较正 常人水平显著降低，用类固醇治疗能够显著增加I L 一1 2 阳性细胞的数量【3 5 】； I L _ 1 2 能够抑制暴露于过敏原后的过敏性炎症反应和I g E 的产生，有报道I L - 1 2 治疗经抗原诱发的哮喘小鼠，能减少小鼠B A L F 中E O S 水平，抑制I g E 的合成并 降低气道高反应性吟丌。I L 一1 2 能刺激N K 细胞和T 细胞产生I F N Y ，在体外I L - 1 2 能促进老鼠和人类T 细胞分化为能分泌I F N Y 和肿瘤坏死因子Q 的细胞，并抑 制T 细胞分化为能分泌I L - 4 的细胞，因此I L - 1 2 可调节T h l 细胞的分化，抑制 T h 2 细胞增殖【6 8 7 0 】。 本实验结果表明，