《雷公藤内酯醇诱导人非小细胞肺癌a549细胞凋亡的实验研究(1)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《雷公藤内酯醇诱导人非小细胞肺癌a549细胞凋亡的实验研究(1)（50页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学 硕士学位论文 雷公藤内酯醇诱导人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的实验研究 姓名：欧阳曙明 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：杨业金 20070601 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 - 2 - 雷公藤内酯醇诱导人非小细胞肺癌雷公藤内酯醇诱导人非小细胞肺癌A549 细胞凋亡的实验研究细胞凋亡的实验研究 硕士研究生 欧阳曙明 指导老师 杨业金 华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系 摘摘 要要 目的目的 探讨雷公藤内酯醇（Triptolide，TPL）对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的 抑制作用及促A549细胞凋亡的分子机制，为雷公藤内酯醇治疗非小细
2、胞肺癌提 供一定的实验依据。 方法方法 1、以A549细胞为细胞模型，采用MTT法测定不同浓度不同时间TPL对 A549细胞的增殖抑制作用。2、采用琼脂糖凝胶电泳法（DNA ladder法）、吖啶 橙/溴乙啶(AO/EB)荧光染色法检测A549凋亡。3、采用Caspase-3活性检测法分析 TPL促A549细胞凋亡机制。4、采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测 A549细胞Survivin mRNA的水平，分析其凋亡调控途径。 结果结果 1、在浓度6.25-100ng/ml、时间12-48h检测范围内，TPL对A549细胞增殖 抑制作用同对照组相比具有显著差异（p0.05）。2、DN
3、A ladder法检测到DNA 梯状条带，证明A549细胞凋亡的发生；AO/EB荧光染色法检测到凋亡细胞特异 性形态学改变，且48h内凋亡率随着时间延长而增加（p0.05）。3、TPL激活 Caspase-3， 48h内Caspase-3活性较对照组有显著提高 （p0.05） ， 12h处活性最大； TPL浓度6.25-100ng/ml内，Caspase-3活性升高，并具有浓度依赖性（p0.05）。4、 TPL显著抑制A549细胞Survivin mRNA水平（p0.05）。5、Survivin mRNA水平 与Caspase-3活性呈负相关。 结论结论 低浓度TPL能有效抑制A549细胞的增
4、殖，这种抑制作用与TPL激活 Caspase-3，降低Survivin mRNA水平从而促进细胞凋亡有关。 关键词关键词 雷公藤内酯醇；非小细胞肺癌；细胞凋亡；半胱天冬酶3；Survivin 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 - 3 - Induction of apoptosis in human Non-small cell lung cancer A549 cells by triptolide Abstract Objective To investigate the proliferation inhibitory effect， the apoptosis-inducing a
5、ctivity of triptolide on A549 cells and take an initial approach on the mechanism of the apoptosis. Methods Non-small cell lung cancer cell line A549 was used in this study. The effects of triptolide on cell proliferation were observed in vitro by MTT method. The apoptosis was evaluated by DNA ladde
6、r and AO/EB fluorescent staining. Measurement of Caspase-3 activity and Survivin mRNA lever was taken to explaine the initial mechanism of apoptosis. Results Triptolide exhibited a marked antiproferative effect on A549 cells within the concentration from 6.25 to 100ng/ml and the time from 12 to 48 h
7、ours(p0.05). The apoptotic ratio was time-dependant in 48 hours(p0.05). The activity of Caspase-3 activity had a significant increase compared to the control group in 48 hours （p0.05） and reached a maxlmum after 12 hours treating of triptolide. Likewise, Caspase-3 activity had a direct correlation w
8、ith the concentration of triptolide during 6.25 to 100ng/ml （p0.05） . However， the lever of Survivin mRNA had a significant decrease compared to the control group（p0.05）. Furthmore, it had a negative correlation with the Caspase-3 activity . Conclusions Triptolide can inhibit the proliferation on A5
9、49 cells effectively at a low concentration. The effect may be correlated with the apoptosis-inducing activity through the Caspase-3 activation and down-regulation Survivin mRNA from triptolide. Keywords Triptolide; Non-small lung cancer; Cell apoptosis; Caspase-3; Survivin 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 - 1 -
10、常用缩略语常用缩略语 AO acridine orange 吖啶橙 bp base pair 碱基对 Caspase cysteinyl-aspartate-specific proteinases 半胱天冬酶 DMSO dimathyl sulfoxide 二甲基亚砜 DTT dithiothreitol 二硫苏糖醇 EB ethidium bromide 溴化乙锭 EDTA ethylene diamine teraacetic acid 乙二胺四乙酸 GAPDH glyceraldehyde-3-phosphatedehy drogenase 磷酸甘油醛脱氢酶 h hour 小时 IAP
11、 inhibitor of apoptosis proteins 凋亡抑制蛋白 IC50 50% inhibiting concentration 半抑制浓度 ml microlitre 毫升 MOPS 3-(morpholino) propanesulfonic acid 3-吗啉基丙磺酸 mRNA messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸 MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte-trazo lium bromide 甲基噻唑基四唑盐 ng nanogram 纳克 nm nanometer 纳米 OD opti
12、cal density 吸光度 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲盐水 rpm revolutions per minute 每分钟转数 RNase ribonuclease 核糖核酸酶 RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction逆转录聚合酶链反应 s second 秒 SDS sodium dodecyl sulphate 十二烷基硫酸钠 TPL Triptolide 雷公藤内酯醇 Tris Tris-hydroxymethyl aminomethane 三羟甲基氨基甲烷 V volt or
13、 volume 伏特或体积 g microgramme 微克 l microliter 微升 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日 期： 2007 年 5 月 9 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论
14、文被查阅和 借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期：2007 年 5 月 9 日 日期： 2007 年 5 月 9 日 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 - 4 - 前前 言言 雷公藤( tripterygium wlfordii hook. F)为卫矛科雷公藤属木质藤本植物，主要 产于中国南部地区，具有解毒散结、活血化瘀、扶正祛邪、抗炎、免疫抑制、抗 肿瘤和抗生
15、育等多种药理作用1 ，早在上世纪80年代末期就已正式应用于临床 治疗风湿性疾病，抗风湿疗效显著，随后又用于治疗自身免疫性疾病、器官移植 后免疫排斥、肾病、哮喘、肿瘤等。其提取物的成分较复杂，雷公藤内酯醇 ( triptotide，TPL) 、雷公藤红素( tripterine) 、雷公藤内酯酮( triptonide)和雷公藤 乙素( tripdioMe)是其主要活性成分2。其中雷公藤内酯醇又名雷公藤甲素、雷公 藤内酯，是雷公藤中分离到的二萜内酯化合物，其抗肿瘤作用已为国内外学者所 证实，且具有广谱、高效等突出的优越性，但目前抗肿瘤机制尚未明确3-7。 肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，也是全世
16、界恶性肿瘤致死的首要因素。 我国肺癌发病率从1973年至1990年平均年递增率为11.9%。有专家预测，2025年 我国肺癌死亡人数将达90万至100万人。临床上常将肺癌分为小细胞肺癌和非小 细胞肺癌，其中后者又占80，二者的治疗和预后截然不同。临床上非小细胞肺 癌的治疗主要采用手术切除加上术后化疗及放疗的综合治疗手段， 因其较之小细 胞肺癌对化疗药物敏感性较差，其治疗效果及远期生存质量仍有待进一步提高。 作为祖国传统医学的中医药， 国内报道其在改善非小细胞肺癌生存期和提高生活 质量方面有其特色8。 癌症是多基因控制的疾病。表面上看来，癌症的表型是多种多样的，发病的 细胞类型各不相同， 细胞恶性增殖的原因也不同。 但是， 在这些复杂的表型之后， 隐藏着相同的癌症发生的“原理”：癌症的发生一方面
