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1、福建医科大学 硕士学位论文 雷公藤内酯醇对肝癌Bel-7402、Hepg2细胞体内外作用的研究 姓名：张鑫 申请学位级别：硕士 专业：内科学（血液病） 指导教师：陈元仲 20080301 福建医科人学帧I 二学位论文雷公藤内酯醇体内外抗盯痛作用的研究 缩略语 A O ：a c r i d i n eo r a n g e 吖啶橙 c D N A ： c o m p l e m e n t a r yD N A ，与m R N A 互补D N A D E P C ：d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ，焦碳酸二乙酯 D M S O ：d i m a t
2、h y ls u l f o x i d e ，二甲( 基) 亚砜 D N AL A D D E R ：D N Af r a g m e n t a t i o n ，D N A 片段化 E B ：e t h i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭 E D T A ：e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d7 , - - 胺四乙酸 H R P ：h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，辣根过氧化物酶 I C 5 0 ：l e n t ec o n c e n
3、t r a t i o n ，中效浓度 M T T ：3 一( 4 ，5 ) - d i m e t h y l t h i a h i a z o l ( 一2 - y 1 ) - 3 ，5 - d i p h e n y l t e r a z o l i u m b r o m i d e ，噻唑蓝 O D ：o p t i c a ld e n s i t y ，光密度值 P B S ：p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n ，磷酸盐缓冲液 R T - P C R “ r e v e r s et r a n s c f i p
4、t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，逆转录聚合酶链式反 应 r p m ：r o t a t ep e rm i n u t e ，每分钟转速 S D S ： S o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，十二烷基磺酸钠 T P L ：t r i p t o l i d e ，雷公藤内酯醇 T r i s ：t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ，三( 羟甲基) 氨基甲烷 T U N E L ：t e r m
5、i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s em e d i a t e dd U T Pn i c ke n dl a b e l i n g ，末端脱氧核苷酸转移酶介导的d U T P 缺口标记技术 2 学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 7 - 研究 工作所取得的真实成果。除文中已注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到
6、本声明的法律结果由本人承担。 作者签名( 手写) ：监 导师签名( 手写) ： 么亟一年一互月一 一一丝噬二年L 月- 7 - 同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 ( 保密的学位论丈在解密后适用本授权书) 作者签名( 手写) ：楗 导师签名( 手写) j k 曼1 1 一一年一一月一L F 1 一一二坦一年 6At I 福建医科
7、人学硕J ：学位论文雷公藤内酯醇体内外抗盯痛作用的研究 雷公藤内酯醇对肝癌B e l 一7 4 0 2 、H e p 9 2 细胞 体内外作用的研究 硕士研究生：张鑫 导师：陈元仲教授 摘要 一、背景： 原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，高度恶性、预后差，如不经治疗， 一般于出现症状后4 - - - 6 个月死亡。手术切除、化疗、放疗、介入治疗是本病的 常用治疗方法，其中手术切除为首选，但是大多数患者确诊时已发展到中晚期， 此时多数病人的肝功能和体质状况较差，能做肝切除手术者不到2 0 。常用的 化疗药物目前有阿霉素、氟尿嘧啶、顺铂等，但效果不够理想，因此人们目前 仍在寻求高效低毒的化疗药物
8、。 雷公藤内酯醇( T r i p t o l i d e ，以下简称T P L ) 是从卫矛科雷公藤属植物雷公 藤中分离到的二萜内酯化合物，分子式C 2 0 H 2 4 0 6 ，分子量为3 6 0 4 ，临床上己 广泛应用于自身免疫性疾病，如类风湿关节炎、肾炎、红斑狼疮等的治疗。近 年来的研究发现T P L 具有广泛且高效的抗肿瘤作用。通过3 0 多年的研究发现 T P L 对人白血病、淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤、胃癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、 卵巢癌、肺癌、结肠癌和黑色素瘤等6 0 多种肿瘤细胞均有很好的抑制作用。T P L 对肝癌细胞同样具有很好的抑制作用，近年来的研究发现T P L 能抑制
9、 S M M C 一7 7 2 1 、H e p 9 2 等肝癌细胞增殖及诱导其凋亡，但未见有关T P L 对肝癌 B e l - 7 4 0 2 细胞体内外作用的报道。 二、目的： 本课题以肝癌细胞株B e l 一7 4 0 2 、H e p 9 2 及B e l - 7 4 0 2 细胞裸鼠移植瘤为对象， 研究T P L 体内外抗肝癌作用，并对其机制进行初步研究，为临床应用提供理论 基础。 三、方法： 1 采用M T T 比色法、集落形成实验检测不同浓度T P L ( 5 “ - - 8 0 n g m 1 ) 对 B e l 一7 4 0 2 细胞及H e p 9 2 细胞增殖的抑制作用
10、。 2 采用A O E B 荧光染色、T d T 酶介导的缺口末端标记( T U N E L ) 法、D N A 片 福建医科人学硕j 二学位论文 雷公藤内酯醇体内外抗盯癌作用的研究 段化检测及电镜观察细胞超微结构等方法检测不同浓度T P L ( 5 “ 一8 0 n g m 1 ) 对肝 癌B e l 一7 4 0 2 及H e p 9 2 细胞凋亡的影响。 3 采用R T - P C R 技术检测经T P L ( 2 0 、4 0 、8 0 n g m 1 ) 作用后B e l - 7 4 0 2 细胞 b c l 2 、b a x 、c m y c 基因m R N A 表达水平的改变。
11、4 采用肿瘤生长曲线及抑瘤率评估T P L 对B e l 7 4 0 2 细胞裸鼠异种移植瘤 的作用：于裸鼠皮下接种对数生长期的B e l 7 4 0 2 细胞，建立肝癌B e l 7 4 0 2 细胞 裸鼠异种移植瘤模型。待肿瘤直径达O 5 c m 时随机分组，每组6 只，分为5 组， 分别为：( 1 ) 阴性对照组：给予含2 丙二醇的生理盐水；( 2 ) 阳性对照组：给 予3 0 m g k g5 一氟尿嘧啶；( 3 ) T P L 组：分别给予1 0 0 p g k g 、2 0 0 9 9 k g 、4 0 0 1 a g k g T P L 。给药方式为尾静脉注射，隔天给药，共7 次
12、。给药期间定期测量肿瘤的 长径( a ) 、短径( b ) ，按公式V = a b 2 2 计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。并 定期观察裸鼠体重的变化及进食量等。末次给药后2 4 小时，处死裸鼠。完整 剥离瘤块并称取离体瘤块重量、计算抑瘤率；透射电镜观察T P L 对B e l 7 4 0 2 细胞裸鼠移植瘤组织细胞超微结构的影响；同时摘除眼球取血检测血常规及肝 肾功能，并取心、肝、脾、肺、肾等组织作病理检查以检测T P L 对裸鼠的毒 性作用。 四、结果： 1 T P L 可抑制肝癌B e l - 7 4 0 2 细胞及H e p 9 2 细胞增殖，且这种作用具有时间及 浓度依赖性。T P
13、L 对B e l - 7 4 0 2 细胞及H e p 9 2 细胞作用4 8 h 的I C 5 0 分别为 4 2 8 2 n g m l 、7 3 2 n g m l 。 2 T P L 可诱导肝癌B e l 7 4 0 2 细胞及H e p 9 2 细胞凋亡。A O E B 双染法结果证 实T P L 可诱导肝癌B e l 一7 4 0 2 及H e p 9 2 细胞凋亡，透射电镜也显示T P L 可诱导 B e l 7 4 0 2 细胞凋亡。T U N E L 法检测5 、1 0 、2 0 、4 0 、8 0 n g m lT P L 处理4 8 h 的B e l - 7 4 0 2
14、细胞及H e p 9 2 细胞，显示两种细胞均有不同程度的凋亡细胞出现，B e l - 7 4 0 2 细 胞的凋亡率依次为9 2 、1 9 8 、3 0 2 、5 2 0 、6 4 6 ，H e p 9 2 细胞的凋亡率 依次为1 5 O 、3 1 6 、4 9 2 、5 8 7 、6 9 1 。D N A 片段化检测可见T P L 处理组 细胞呈现典型的梯形条带。 3 T P L 可调控B e l 7 4 0 2 细胞凋亡相关基因的表达。R T - P C R 显示，分别 以2 0 、4 0 、8 0 n g m l 的T P L 处理B e l 一7 4 0 2 细胞4 8 小时后，c
15、m y c 、b c l 一2 基 4 福建仄科大学硕1 j 学位论文雷公藤内酯醇体内外抗盯痛作用的研究 因的m R _ N A 表达下调，b a x 基因的m R N A 表达上调，且呈浓度依赖性。 4 T P L 可抑制B e l 7 4 0 2 细胞裸鼠异种移植瘤的生长。尾静脉注射T P L 1 0 0 u 眺g 、2 0 0 ug l ( g 和4 0 0 ue C k g 后，T P L 对B e l 一7 4 0 2 细胞裸鼠异种移植 瘤的抑瘤率分别为2 7 2 ( p 0 0 5 ) 、5 0 O ( p 0 0 5 ) 、5 0 O 0 o 0 5 ) ，提示各组模型治疗前瘤体
16、大小具有可比性。给药结束后， 1 P L2 0 0pg k g 、4 0 0I Ig I 【g 治疗组及5 - F U 组肿瘤生长速度较阴性对照组明显减 慢，且4 0 0 l ag k gT P L 治疗组较2 0 0 l ag k gT P L 治疗组更明显，1 0 0 p 鲫( gT P L 治疗组起初生长缓慢，在给药最后2 天增长迅速，表明T P L 低浓度对肝癌作用 不明显，而中、高浓度可明显抑制肝癌生长，且呈剂量依赖性( 图2 1 ，2 ) 。 吕 U 器 蛙 懊 1 4 1 2 0 8 0 6 0 4 0 2 0 1 01 21 41 6 1 82 0 2 22 4 2 62 8 天数( d ) 一阴性对照 阳性对照 l O O u g k g T P L 2 0 0 u g k g T P L 4 0 0 u g k g T P L
