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1、雄性三倍体长牡蝎繁殖潜力的初步研究 丁君 张国范 “ 常亚青李霞 宋坚巩宁 2 ( 1 . 大连水产学院， 农业部海水增养殖生态学重点实验室， 辽宁大连，1 1 6 0 2 3 2 . 中国 科学院海洋研究所，山东青岛， 2 6 6 0 7 1 ) 摘 要利用流式细胞仪及镜检对雄性二、三倍体长牡蜘的生殖细胞进行分析，证明雄性三 倍体长牡W可以产生有活力的精子，这些精子可以 使正常二倍体卵细胞受精，但从整体看雄 性三倍体长牡砺性腺成熟较二倍体滞后，且同步性差。 关扭词长牡蜻.繁殖潜力.流式细胞仪 A b s t r a c t T h e re p ro d u c t i v e c e l
2、l o f d i p lo i d y a n d t i p l o i d y P a c i f i c o y s t e r , C r a s s o s t r e a g i g a s w e re a n a l y z e d . T h e r e s u l t s s h o w t h a t s m a l l p a rt o f m a le t r i p lo i 勿o y s t e r c a n p r o d u ce l i v i n g s p e r m s a n d t h e re s p e r m c a n m a k e
3、t h e n o r m a l d i p lo i d y e g g s f e rt i l i z e a n d y i e l d a n e u p lo i d y e m b ry o , b u t l a r g e p a rt o f t h e m c a n o n l y p ro d u ce i m m a t u re s p e r m ce l l . T h e t e s t a l s o f i n d t h a t t h e m a t u r e t i m e o f m a le t ri p l o i 介g o n a d
4、i s l a t e r t h a n n o r m a l d i p lo i d y , a n d t h e i r s y n c h ro n i z a t i o n i s n o t a s g o o d a s d i p lo i d y . k e y w o r d s P a c i f i c o y s t e r C r a s s o t r e d g i g a s , re p r o d u c t i o n p o t e n t i a l i t y , f lo w c y t o m e t ri c 国内 外很多人做过三倍体
5、长牡场的 诱导工作， 但在三倍体性腺发育及配子活力方面的研 究，目 前 仅见A lle n 等对三 倍体的 海娜和长牡蝎异常配子的 发生进行报道， C o x l4 l 研究了 悉 尼岩牡场三倍体性膝发育情况， 姜卫国等对三倍体合浦珠母贝的生殖膝进行了观寮， 李 该川对三 倍体长 牡蚜的 性腺 发育做了 较系 统的 分析和总 结。 作者 用流式细胞仪对长牡蜘二、 三倍体的性腺细胞进行了初步分析，回 答了三倍体长牡砺生殖潜力及性比方面的一些间题， 为进一步研究三倍体长牡骊的生长、 萦殖、 杂交莫定了 理论基础。 1 材料与方法 1 . 1 实脸材料 材料取自 大连红星养殖公司， 其中三倍体长牡砺
6、在1 9 9 9 年春用6 - - D M A P 进行诱导处 理， 2 0 0 0 年4 - 5 月在大连水产学院海养樱人工促熟培养。 1 . 2 倍性鉴定方法 取少量姐丝， P a rt e c P A S 一 lu 型流式细胞仪侧其倍性。 1 . 3 性膝现案方 法 将长牡拐剖开， 观察其性腺发育情况， 在显微镜下辨雌雄。 1 . 4 利用旅式翻饱仪对生抽翻.进行分析 用手术刀片割开性膝、 D A P I 染液冲 洗性膝， 收集、 制样。P a r t e c P A S 一 m 型流式细胞仪 进行侧试。 2 结果 2 . 1 长牡蝠倍性鉴定结果 分 析鉴定长牡蜘共 1 4 5个， 其中
7、三倍体 3 8个，二倍体 1 0 7 个，三倍体倍化率为 2 6 . 2 %。二倍体长牡砺中雌雄比 接近1 : 1 。三倍体雌雄比为1 : 1 8 。二者都有雌雄同体现象。 三倍体的雌雄同体率为4 %0 2 . 2 二倍体长牡蝠的性腺观察及利用流式细胞仪对其生殖细胞分析结果 所检测的1 0 7 个二倍体长牡砺中，有 1 0 5 个达到性成熟，占9 8 %。性成熟的二倍体长 牡w生殖腺很饱满， 性腺几乎夜盖整个内脏囊， 外观呈乳白色或淡黄色， 性腺表面叶脉状生 殖输送管清晰可见， 镜下观察精子活力极强。 把正常二倍体长牡砺鳃丝细胞的D N A含量定为2 0 0 ，图I 为一典型的二倍体雄性生殖
8、细胞D N A的 相对含量直方图， 其中横轴代表D N A的相对含量， 纵轴代表细胞数。峰1 代 表 此时精巢中的大部分细胞已完成减数分裂， 成为精子细胞或精子，其D N A相对含量为 1 0 0 0 峰2 显示精巢中 有部分细胞已经过减数第一次分裂， D N A含量减半至正常体细胞水 平， D N A相对含量为2 0 0 ， 为次级精母细胞。峰3 显示精巢中 有一些细胞的 D N A刚完成复 制， 为初级精母细胞， 其D N A的相对含量为4 0 0 。实验证明峰 1 所占的比例越大，精子的 活力越强。当 食物不足或其他原因 造成长牡蝠性腺退化时， 不但性腺外观饱满度下降， 在流 仪图上也显
9、示峰1 的比 例大大降低，而 峰2 的比 例则增加。因此， 定期用流式细胞仪监测长 牡V性腺的发育 情况可较好地掌握其人工 授精时间。 2 . 3 三倍体性碑观案及利用流式细胞仪对其生殖细胞分析结果 所检测3 8 个三倍体长牡砺中 有3 6 个生殖腺消瘦，内 脏团囊表面部分有淡淡一层灰白 色 生殖腺，主要分布于背消化腺周围， 可微见消化囊的颜色。镜检有少量精子状细胞，无活 力， 不能使正常卵 受精。以 正常二倍体长牡砺缘丝细胞的D N A含量为标准，图2 、图3 显 示 这些三倍体性腺中的生殖细胞仍停留在初级精母细胞和次级精母细胞时期， 其细胞的 D N A相对含量分别为6 0 1 和3 0
10、0 0 500绷200 峰 细旅报率加00 内目.且 盈it 2 1“ 3l it I It 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 D N A相对含1 t 0 I _ 一山 如 一 确 m 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 . D N A相对含f 图1 正常二倍体长牡骊生图2 三倍体长牡蜘生殖细胞D N A 殖 细 胞。 N A 相 对 含I相 对 含f( 示 初 服 精 母细 胞) 另外， 有2 个三倍体长牡砺性腺较饱满， 性腺砚盖于内脏囊上， 可见表面的叶脉状生殖 管。产生的配子细胞有活力， 可使正常卵授精， 但受精卵排出极体的时间及细胞开始分裂时 间都较正常受精卵迟。把正常二倍体
11、长牡砺鳃丝细胞的D N A含量定为2 0 0 ,流仪检测这两 出 个长牡砺性腺细胞的D N A相对含量为1 5 0 ， 结果显示其精细胞或精子D N A的相对含量为 1 5 0( 图4 ) ， 说明 其已完成减数分裂， 形成了 成熟的精细胞或精子。用流仪检测其受精卵发 育的 担轮幼虫. 发现细胞中D N A的相对含量为2 5 0 ， 为非整倍性。 细胞翻率5000500 细胞孩率父0050 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 D N A相对含A 2 0 0 4 0 0 6 0 0 D N A相对含a 图3 三倍体长牡蜘生殖细胞D N A 相对含t ( 示次级精母细胞) 图4 三倍体长牡砺生
12、殖细胞D N A相对 含t 示精子细胞或精子) 3 讨论 3 . 1 三倍体长牡场精子的发生 A l l e n 等在1 9 9 0 年用组织学方法观察了 海娜和太平洋长牡砺异常配子的形成过程， 提出 三 倍体性 腺发育 较二倍体差， 产精、 卵的 数量少。 C o x 4 报道悉尼岩石长牡砺三倍体性腺 结 构， 没有发现成熟精、 卵。 姜卫国， 何毛贤1 9 9 0 年对三倍体合浦珠母贝生殖腺进行研究， 认为 雄性三倍体没有成 熟精子形成， 而李彼 观察到三倍体长牡m在成熟期， 滤泡内 有大 量成熟精、 卵， 生殖管道内 也有大t精、 卵排出。 作者认为在适当的条件下， 雄性三倍体长 牡场能
13、通过减数分裂产生有活力的 精子， 但其雄配子的 发生明显滞后于二倍体， 且发生极不 同步。三倍体精子能 使正常的卵受精， 产生非整倍体的 幼虫。非整倍体受精卵较正常受精卵 在发育上滞后。 3 . 2 三倍体长牡临的性比问 瓜 A l l e n 等 ( 1 9 8 6 ) 发现三倍体海娜中雌性占7 7 %， 有1 6 %可能为雌性或雌雄同体， 6 % 不能确定性别，未见到雄性个体。姜卫国等在 5 3 个合浦珠母贝中观察到 3 个雄性 ( 5 . 6 6 % ) , 5 0 个 雌 性 ( 9 4 . 3 4 % ) ， 没 有 见到 雌雄同 体。 王 永平 2 1 等 在在二 倍体长牡 砺的
14、雌 雄性比 接近1 : 1 时， 三倍体长牡舫的雌雄性比 为1 : 1 9 ， 有少量雌雄同体 ( 6 . 4 %) 。在此次 实验中也发现二倍体的雌雄比 为1 : 1 时， 三倍体长牡砺的雌雄性比1 : 1 8 ， 雌雄同体占4 % 0 三 倍体软体动物性比 异常的问题极为普遗， 除了 外界环境的 影响 ( 如食物， 水温) 外， 作者 认为还和染色体的 增加有关。 海洋动物 性别 决定的机理十分复杂 3 1 ， 细胞学和遗传学研究表明 海洋动物一般缺乏性 染色体或处于性 染色体进化的初级阶段， 不少种类性别受多基因 形响， 这些基因 分布在不同 的染色体上， 存在着一种数量平衡。 其次，
15、大部分海洋无脊椎动物无异形性染色体， 它们更 多地表现为数t性状的 特点， 即对环境变化比 较徽感， 易受环境变化的 影响， 如食物， 水温 等都会对它的 性比 产生影响， 表现为仿徨变异。而三倍体长牡砺染色体的加倍会破坏原有的 数 量平衡， 造成性比 紊乱。 另外， 也由 于三倍体长牡砺在繁 殖季节， 能量分配和二倍体不 同， 它的大部分能量用于生长， 造成实际上三倍体用于性腺发育的能量远远少于二倍体， 为 间 接性食物影响性别。 综上 所述， 三倍体长 牡.0的 性比 变化可能是由以上两 个原因 共同引起 的。 参考文献 李及， 张国范 三倍休长 牡W性腺发育的组织学研究 大连水产学院学报
16、 ( 2 王永平三 倍体长牡骊生殖潜力的 研究. 大连水产学院硕士论文，1 9 9 8 3 张璀， 马军英，范晓. 海洋动物的性比 海洋生物技术原理和应用. 5 9 -6 2 ( 4 ) C o x E . S . S t u d i e s o n t r ip lo id o y s t e r in A u s t e a l ia : V I g o n a d d e v e lo p m e n t in d o y s t e rs S a o o t r e a o a n u n e r c ia l is ( I r e d a le a n d R o u g l il e y ) . J . E x p . M a r . B io l 1 2 0 1 9 9 9 , 1 4 ( 2 ) : 1 -6 北京: 海洋出版社，1 9 9 7 , E m l . ，1 9 9 6 , 1 9 7 : 1 0 1 一 2 1 4
