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1、 一个AB型开米拉家系遗传状态的研究 作者：杨宝成 喻琼 苏宇清 周丹 金士正 李茜 梁延连 邓志辉【摘要】 为了研究罕见开米拉血型家系的基因遗传状态，对先证者家系部分样本进行ABO基因序列测定，用流式反向序列特异性寡核苷酸探针方法测定HLAA、B、DRB1基因位点，用PCR序列特异性引物法测定HLAA、B、DRB1基因位点，对16个短串联重复片段位点进行荧光标记复合扩增。结果发现： A3B3型家系的2个体中，ABO基因、HLAB、DRB1基因、多个STR位点出现了2个以上的等位基因。结论： 利用基因分型技术分析开米拉血型能清楚地提示
2、此罕见血型的遗传状态,增进了对此遗传方式的认识。 【关键词】 开米拉血型，ABO， HLA， STR Abstract In order to study the genetic status of a rare chimeric family, some samples of A3B3 family were identified by sequencing of ABO gene; flowrSSO and PCRSSP were used to detect
3、 loci of HLAA,B,DRB1 genes, and multiplex amplifying with fluorescencedye were performed for 16 short tandem repeat (STR) loci. The results indicated that two individuals from A3B3 family contained more than two alleles at ABO gene, HLAB,DRB1 and some STR loci. In conclusion, analysis of
4、 chimeric blood group by using genotyping techniques clearly demonstrating genetic status of this rare chimeric blood group promotes further elucidation of the existing state of specific genetic status. Key words Chimeric blood group, ABO, HLA, S
5、TR 开米拉的定义是个体细胞来自两个或多个不同的受精卵。人类血型开米拉可能是遗传性的，也可能是在移植、输血过程中通过输注异源的造血细胞而获得的。先天性开米拉发生在两个受精卵或多个受精卵的胎儿发育中。人类开米拉血型是非常罕见的，常在ABO血型鉴定中存在着混合外观的凝集而引起注意1-3。我们实验室在1例ABO亚型的研究中发现其家系存在开米拉现象，现报道如下。 材料和方法 对象 先证者是1名23岁的男性无偿捐血者，他的ABO血清学定为
6、A3B3型，采集到先证者及其弟弟的血液不抗凝血样5 ml。由于先证者父亲去世，未采集到其血液标本。对先证者母亲、哥哥、嫂子及孩子共计4人所采集标本由于条件所限，未能抗凝，只作了ABO血清学血型测定，而未能作进一步分析。本家系个体均为无输血史和移植史的健康个体。 血型血清学检测 血型正反定型按中国输血技术操作规程操作进行。其中试剂单克隆抗A、抗B血清（BIOSCOT, Serological Ltd, UK），抗AB血清（Immucor Inc, Norcross, GA30071， USA），抗H植物凝集素（长
7、春博德公司产品），反定型红细胞为本实验室自制。 基因组DNA提取 PUREGENE快速盐析法抽提先证者与弟弟2个样本的基因组DNA，DNA终浓度调节至100 ng/l，A260/A280在1.70。 ABO基因第6、第7外显子直接序列检测 参照Olsson设计的2对引物4，5CGGAATTCACTCGCCACTGCCTGGGTCTC3, 5CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA3，用于扩增ABO基因第6外显子。5GGGCC
8、TAGGCTTCAGTTACTC3,5CGGGATCCCCGTCCGCCTGCCTTGCAG3，用于扩增ABO基因第7外显子，中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)一个AB型开米拉家系遗传状态的研究引物由上海生物工程所合成。PCR扩增体系包括：每种dNTP 400 mol/L，Mg2+ 2.5 mol/L，Taq酶3 U，模板DNA 500 ng，引物每条0.1 mol/L，终反应体系50 l，循环参数为： 95 10分钟，94 60秒,63 90秒,72 60秒，10个循环；94 60秒 ,61 90秒,72 60秒，25个循环，72
9、10分钟。扩增产物经TaKaRa DNA Fragment Purification Kit(大连宝生物公司产品)纯化，使用循环测序试剂盒（Big Dye Terminator Cycle sequencing Kit，美国ABI公司产品）直接测序，测序的引物与本研究扩增ABO基因第6、7外显子的引物序列相同，正、反方向通测，在ABI3100 DNA测序仪上检测、SeqPOP6BDv1软件分析结果。 HLAA、B、DRB1基因位点的流式磁珠反向序列特异性寡核苷酸探针法（FlowrSSO）检测 将DNA样本、底物、Taq酶、
10、引物混合并混匀，加入至扩增板中，按试剂盒（On1elambda公司产品）说明书中的扩增条件进行扩增，扩增后的DNA再按操作说明书进行杂交、染色和读板，由Luminex100IS分析软件分析出HLAA、B、DRB1的结果。 HLAA、B、DRB1基因位点的聚合酶链反应序列特异性引物（PCRSSP）分型法检测 试剂由美国G&T公司提供。每一标本反应体系为9 l，内对照为扩增人类生长激素（HGH）基因，目的扩增产物为796 bp或429 bp，扩增采用热启动技术，即95预温5分钟，然后95 30秒，60 30秒，72 9
11、0秒，30个循环，72延伸5分钟。PCR产物检测经2%琼脂糖凝胶电泳20-25分钟，紫外灯下拍照、打印照片、记录结果。 16个短串联重复片段（short tandem repeat, STR）位点荧光标记复合扩增 采用10 l扩增体系，内含PCR 反应混合物4.25 l，荧光标记引物2.5 l，金牌Taq酶（5 U/l）0.25 l，模板DNA 3 l（约3 ng）。热循环参数： 95预变性11分钟；94 1分钟，59 1分钟，70 1分钟，共28个循环，60 延伸45分钟，最后25下恒温保存。检测的16个STR位点包括：
12、D5S818, D13S317, D7S820, D8S1179, D21S11, D18S51, D3S1358, vWA, FGA, TH01, D16S539, D2S1338, D19S433, TPOX, CSF1PO和性染色体上Amelogenin位点。荧光标记引物（Identifiler试剂盒）由美国PE公司提供。PCR产物采用ABI3100测序仪进行电泳和检测、GeneScan3.1和GeneTyper3.7软件分析STR基因型。 结 果 血清学结果
13、; 先证者与单克隆抗A、抗B血清在显微镜下呈混合外观，与抗H反应呈强阳性，血清与标准A细胞、B细胞无反应。其余个体均为正常ABO血型家系，家系成员的ABO血型见图1。 Figure 1. Schematic diagram of the inheritance of A3B3 in a family. The phenotype determined are indicated by capital letter. Arrow head indicates propositus. Sample shown in dashe
14、d square was not studied. ABO血型基因序列测定结果 与A101等位基因参考序列（GenBank注册号：AF134412）相比较，先证者为核苷酸位（nt）297A/G、646A/T，681A/G、771C/T、829A/G位有杂合，具有B基因特点的nt297A>G，O02基因特点的nt646T>A，681G>A、771C>T、829G>A，其余位点为A101等位基因的特点；弟弟为nt297A/G、261G有1链缺失、646A/T，681A/G、771C/T、829A/
15、G位有杂合，具有B基因特点的nt297A>G，具有O01基因特点的nt261位有一链缺失G，O02基因特点的646T>A，681G>A、771C>T、829G>A,其余位点为A101等位基因的特点。 HLA基因位点结果 FlowrSSO法检测结果显示，先证者为A2，；B39(05)，51；DRB1*8，16；其弟弟为A2，；B51，52；DRB1*15，16。PCRSSP检测结果表明，先证者为A2，B39，51,58；DRB1*8，13，16；其弟弟为A2，；B51，52；DRB1*13，15，16。PCRSSP检测发现这两个体HLADRB1基因均出现了3个位点，一个个体HLAB基因出现了3个位点，B58的电泳条带不是太清晰。结合PCRSSP与FlowrSSO检测结果分析，可以得出HLAB58与HLADR1*13等位基因在体内少量存在。先证者弟弟的HLADRB1 SSP检测结果见图2。 Figure 2. Electrophoresis result of PCRSSP for a propositus brother.
