阵列显微镜及其应用

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1、阵列显微镜及其应用 吴 波( 综述) ( 南京军区南京总医院) 摘要：近年来，随着远程病理诊断的发展、病理图像数据 库建立、网上病理教学等的需要，病理图片网上传输日益增 加，病理切片的数字化越来越得到病理工作者的重视，并提 出了“虚拟病理切片”的概念。组织切片数字化过程中一个 关键性的问题是切片图像的扫描，目前，图像扫描采用三种 成像方法方法：拼砖成像( t i l e di m a g i n g ) ，推进式扫描成像 ( p u s h - b r o o ms c a n n i n g ) 和飞点扫描成像( f l y i n g s p o ts c a n n i n g ) ，无

2、论那种扫描方式，应用传统单轴显微镜扫描一张切 片可能要超过3 0 分钟，即使使用全自动载物平台的显微镜， 扫描一张切片也要十余分钟，不能满足实际应用的需要，因 此，解决视野与分辨率的矛盾还需要其他新的方法。为此， 研究者提出了一种新的显微镜类型，称为“阵列显微镜”( a r r a r ym i c r o s c o p y ) ，该显微镜的特点就是它的物镜不是传统的 单透镜物镜，而是由6 0 8 0 个相同放大倍数的镜头排列组 成一个镜头阵列，整个阵列物镜的面积超过大多数组织切片 上组织的大小，这样，可以一次性拍摄整个组织各个部位的 高倍图像组，然后，通过计算机的图像拼接技术，将零碎的小

3、图像组合成整个切片的大图像，不但可以看到组织的各个部 分，而且，可以进行任意的缩放，更为重要的是，与目前应用 的方法比较，阵列显微镜制作虚拟切片的时间大大缩短，整 个过程在一分钟之内，可以满足目前大多数病理科每天切片 数字化的需要。具有明显的实用价值。 当然，阵列显微镜的制造需要解决一系列的技术问题， 包括：( 1 ) 相同透镜的高精度加工；( 2 ) 大幅面、小像素的 C C D ；( 3 ) 物镜的自动对焦。 目前这些问题已经基本解决，商品化的显徽镜已经上 市，但带来的问题也是明显的，那就是价格的问题，对于大多 数医院病理科而言，数十万美金的价格是很大的负担。解决 上述问题后，阵列显微镜的

4、应用领域是相当广泛的。 显微镜已成为科学研究的必备工具，今天从生 物医学到度量学领域，各种各样的高分辨的显微工 具正在应用着，有明视野的、暗视野的、相差的和荧 光显微镜等等，品种繁多，它们的共同特点是成像 快，经管各种显微镜有各自的特点及应用范围，但到 目前为止，单光轴显微镜的最大问题是视野和分辨 率的矛盾，就是我们需要观察大的视野时，分辨率就 低，而分辨率高时，视野就小，这一矛盾在病理学领 域制作虚拟切片时显得尤为突出，对于解决上述矛 盾，人们提出了许多方法，包括自动连续摄片的方法 等，受限于机械结构和计算机处理能力，虚拟切片的 制作过程比较耗时，大大影响了它的实用性，近年提 出了阵列显微镜

5、的方法，就是用一组高分辨率镜头 来观察大的视野，边摄像边处理，实时制作出一幅高 分辩、广视野的图像，使虚拟切片制作可以满足日常 工作的需要。 1 广视野图像( B r o a d - A r e aI m a g i n g ) 就目前高倍的平场物镜( f i e l d f l a t t e n e do b j e c t i r e s ) 的加工水平，其视野直径只有1m m 左右，如果 要得到一张大于视野物体的整体图像，你必须对物 体进行扫描观察，为此，研究者提出了三种大图像成 像方法：( 1 ) 拼砖成像法( t i l e di m a g i n g ) ；( 2 ) 推进 式

6、扫描成像( p u s h b r o o ms c a n n i n g ) 和( 3 ) 飞点扫描 成像( f l y i n g s p o t ( w h i s k b r o o m ) s c a n n i n g ) 。拼砖成 像是通过获取一系列有序图像( 图像应有一定边缘 重叠) ，然后运用计算机运算对图像进行拼接，类似 铺瓷砖，构成一张大的图像，其缺点也是显而易见 的，由于每张图像扫描的光学、机械的误差，以及计 算机处理的能力，因此，图像存在变形、色差等失真， 成像时间也比较长；推进式扫描成像的原理是利用 装载在步进马达上的线性检波器( 1 i n e a rd e t

7、 e c t o r ) 进 行整视野的扫描，由于马达推进速度与扫描速度的 差异，这种方法获得的图像也存在每条扫描线之间 的误差；飞点扫描成像原理是运用一个单照度( s i n g l ei l l u m i n a t i o ns p o t ) 的检波器在切片表面有序地摆 动获取图像，飞点扫描成像的方法兼有上述两种方 法的缺点。 上述的三种成像方法从图像采集到制作一幅高 分辨率、广视野图像要花费的时间要超过1 0 分钟， 不能满足许多方面的实际应用，如，年外检量在 2 0 0 0 0 例左右的病理科，每天的组织切片要超过3 0 0 曼遭： 阵i 徽慌A 其庄月 张，通过上述方法材成虚拟

8、切片的话，无法完成每天 的切片虚拟化。因此，蔚决视野与分辨率的矛盾还 需要其他新的方法。 2 舟糟法获取图像( D i v i d ea n dC o n q u e r ) 解决的方法之一就是应用一组显微系统对一个 物体不同的区域弼时进行戚像，但是经典的显徽镜 物镜系统的“视野一物理镜片直径比值”( F O V - t o - p h y s i c a l l e m - d i 姐e t e rr a t i o ( F D R ) ) 在2 5 5 0 之 同如果把遘样的一组镜头组台在一起，对大钫体同 时进行拍摄所获得的图像问睹太大不能合成出一 张完整的大枧野腰像。为丁解决遗一问题来自

9、 A , 协n a sO p t i c a lS c i e n c e eC e n t e r ( T u c 蛐n ，A Z ) 研究 人员发明了一种新的显镦光学物镜系坑，它的F D R 值只有8 ，这种低F D R 值物镜系统的设计主要依籁 于它的独特的非球面镜头可以最大限度碱步每个 韧镜的透镜散量这样，小尺寸、小F D R 的物镜允许 我们组合成一个大的物镜系统可以同时对一个大 物体不同区域同时进行高分辩观察，( 图1 、2 ) 。 固 匿 目2 血s 1 0 十搬小蕾* m * t 女 镕t * 鼍鹰冀t * 点。 由多个微小光学系统构成的二维显徽镜阵刊， 在任何瞬闻拍摄的都是一

10、组复舍的、不连续的图像 为了 訇成一幅完整的大槐野图像阵列图像需措切 片长轴一个方向进行拍摄( 图2 ) ，类似前面提到的 推进扫描成像的方法，阵列中的每个物镜都放大物 体舶一个部分不能反映物体的整体结构每个小囝 像问都有一定的重叠。 解决了镜头之间的光学问睐，阵列中每个小物 镜舶放大图像就不会重叠有设计者使用8 行小物 镜的阵列每行有1 0 十光学物镜，组成了一十广视 野物镜系统，其长度超过坷片的宽度，可以覆盖大多 靛组织切片上的整个组织，这是一种比二维阵刊简 单的线性设计选样一种光学图像传感裴置一次就 产生8 0 个图像信息。如果拍摄范围超过阵列镜头 的范围，装置也设定了建续拍摄的范围，自

11、动确定上 一幅图像与下一幅图像的精确位置。这样拍摄的图 像没有重叠，可以直接用于更大图像的拼接。由于 阵列镜头的宽度与切片一致，所以，我们无须调节视 野宽度的旋纽。我们要做的就是设定一个开始扫描 的位置。阵列镜头组8 0 各镜头的每一个镜头的镜 口滤为06 5 ，视场直径为2 5 0 “m ，每个物镜都设计 为平场物镜，有效孔镜为2 0 0l L I | | ，物镜到组织切片 的距离小于1 0 m m 。 3 阵列显微镜需要解决的问路 1 ) 设计上的困难；首先制造和装配大量相同 的光学透慵用于阵列显徽镑的物镜，需要相同的尺 寸、曲率产生相同的放太倍数因此对物镜的加工 有极高的要求。事实上，制

12、造完全相同的镜头是不 可嚣的，允许一定的误差，但必须在一定范围内，连 就必须建立一个针对多镜头、多图像的窖差分析系 统( 普通的窖差幕缱是耐单个图像系统进行评价) 。 还有多镜头装配时的光学球面差问题。而且，各镜 头互相之同要非常靠近。形成一个整体，因此，组装 镜头需要一系列新的技术支持，包括：注塑成型( n - j e c t i o nm o l d l n g 】，捧版技术( 1 l t h o 弘p h y ) 及激光灼刻 技术( d i r e e t I a 坩w r i t i n g ) 等。 ( 2 ) 图像传癣器的工作模式：图像传感装置制 造是另一十困难，为了解头视野与分辨

13、率的矛盾图 像传感器需要大幅面、小像煮的C C D ，小像素可以 使C C D 的像素密度更高最大限度地提高图像分辩 率但太多数市售的C C D 在物理大小和像素上有一 个固定的规格，为此，一些公司专门设计了一种氧化 金属半导体的图像传感器来解决上述问题目前的 分辨率可以达到05 * m ，同时有超过埔个传输通 道，传输率超过1 2 0M B s 。为了降低噪声设计上 采用真正的二敬抽样阵噪，采取田像的同步进行硬 件压塘，这样减少了图像传感嚣与主机向教据的传 输量。 ( 3 ) 多镜头自动对焦：还有一个困难是自动对 焦。匿为，一张大的组织切片在高放大倍敷下不可能 是非常乎整的，有的组织会脱离切

14、片、有时有气泡 在普通显教镜下观察时可以通过不断地调节显锻 镜焦燕来克腹遘向题，但在辟刊显徽铸下切片图 像有的部分在焦距内，有些部分可能不在焦距内这 镕十：口十目# n # 目4 # * 告* 主# 样形成的虚拟切片就会有部分不清楚，而且不能象 在显微慌下可以通过调节檄谰来清楚地观察切片， 为了解决这一周题，设计者开发了一种病理组织切 片图像的自适应系统，该系统可以自动识别一个主 要的焦距平面，在这个平面上、下的一定范围内，分 别摄腰戚像，通过图像处理技术，可以得到一幅各个 区域都清楚的图像( 图4 ) 。 口3 3 幅目幛* 有杆分E A 清a n 目 E i g * # 5 m # 目*

15、处A 日m 褥g 一幅 各十靠H 都镕m 的m 健。 目4 s m # 目E # 馋* 缱D x 4 0 4 阵列显微镜的应用领域 E 口使装备第一代的图像探测装置的阵列显擞系 统，其田像采集速度比传统的单镜头扫描技术要快 5 1 0 倍左右，而且多物镜一体化的设计使阵列显 微镜所摄取囝像的后续赴理也很简单可以直接进 行大图像的拼接，在高速计算机和逻辑化设计软件 的支持下围像处理变得非常简单、有救，如图像边 缘识别、光照平衡等处理都是在图像摄取后很短时 间内完成。 基于上连快速的成像能力，阵列显微镜在生命 科学、医药卫生领域有着广泛的应用目前最新的阵 列显微镜的处理能力可以达到每小时2 0 4

16、 0 张切 片，分辨率在5 4 0 0 0d m ，这样基车能满足病理科每 天组织切片的数字化要求。 阵列显微镜还有其他方面的应用。如，多光谱显 徽镜、倒置显徽镜、相差显徽镜、荧光显倒置徽镜等 因此我们认为阵列显徽镜将开创快速、高分辨、数 字目像技术的新篇章，促进图像自动化分析技术的 发展。 D X 一4 0 阵列显微镜是世界上最早的由8 0 个小 物镜构成的、商品化的阵刊显徽镑当进行切片扫描 时，显微镜物镜在计算机的控制下，有规剐地滑过切 片表面，快速、准确地获取切片上全部组织的高分辩 固像( 图像大小9 0 0 M ) ，整个过程不到6 0 秒钟。 参考文献 I W e m t e i n 。B s ，I n n w a f i o n s i nm e d i c a l i m 呷q dv i r t u m i e p y H 咖r , l h * l o O 3 6