《阴离子交换蛋白折叠色谱与malditof ms联用对还原变性牛胰岛素折叠的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《阴离子交换蛋白折叠色谱与malditof ms联用对还原变性牛胰岛素折叠的研究（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 o B 0 2 4 阴离子交换蛋白折叠色谱与M A L D I T O FM S 联用对还原变性牛 胰岛素折叠的研究 林翠娥白泉” 西北大学现代分离科学研究所，合成与天然功能分子化学教育部重点实验室，西安7 1 0 0 6 9 ， 关键词：蛋白折叠，液相色谱，还原变性，胰岛素，M A L D I T O FM S 在基冈丁程中，重组蛋白的生产主要是通过外来宿主细胞进行表达，但是许多外源基因在大肠 杆菌( E c o l i ) 中高效表达时，常常以不溶的无活性的沉淀即包涵体的形式聚集于菌体中。如何将无生 物活性的包涵体折叠成可溶的、具有生物活性
2、的重组蛋白，即蛋白折叠问题已成为现代生物工程体 系中的技术瓶颈。对于含有二硫键的包涵体蛋白，必须在还原剂，如肛巯基乙醇或二硫苏糖醇( D 邢 存在的条件卜，用高浓度的变性剂将包涵体溶解，然后再将还原变性的蛋白进行氧化复性，以得到 具有活性的蛋白质。所以如何提高变性蛋白二硫键的正确配对率对重组蛋白药物的生产具有重要的 意义。 通常包涵体蛋白的复性主要采用稀释法和透析法，但是其复性效率非常低，只有5 0 旷2 0 。近 年来液相色谱技术被应朋蛋白折叠研究，已成为蛋白复性并同时纯化的有力工具，称之为蛋白折叠 液相色谱法，并成功应用于重组人干扰素一y ( r h I F N - 丫) 、重组人粒细胞集
3、落刺激因子( r h G C S F ) 、重组 人胰岛素原( r h p r o i n s u l i n ) 希! 重组人肝细胞因子( r h S C F ) 等的复性与同时纯化中。本文拟以牛胰岛素为 模型蛋白，采用阴离子交换色谱与基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱( M A L D I T O FM S ) 联用对 还原变性的牛胰岛素在液固界面上的折叠规律进行研究。 牛胰岛素的分子量为5 7 3 0 D a ，由两条肽链组成，其中A 链内有一个二硫键( c y s 6 c y s I I ) ，A 、B 链间有两对二硫键( c y s A 7 一c y s B 7 ，c y s A 2
4、 0 c y s B l 9 ) 。本文在伊巯基乙醇存在的条件下先用8 0m o l L 脲 溶液对其进行还原变性。将还原变性的牛胰岛素用R P L C 分离后，并用M A L D I T O FM S 检测，结果 表明，胰岛素的二硫键已完全打开而变成了A 、B 两条链。 将2 0 0 “L8 0m 0 1 L 1 脲还原变性的牛胰岛素( 2 m g m E ) 直接进样至D E A E 阴离子交换色谱柱，采用 流动相1 ( A 液，2 0m m 0 1 L T r i s ，p H8 O ；B 液，2 0m m o l L 1T r i s + 1 0m o l L N a C I ，p H
5、8 0 ) 进行3 0 m i n 线 性梯度洗脱，收集胰岛素色谱馏分并经R P L C 分离后采) - l q M A L D I T O FM S 对R P L C 的色谱馏分进行测 定，R P L C 分离结果如图1 1 所示，图1 1 中色谱馏分1 7 的M A L D I T O F M S 结果表明，馏分l 一3 和5 7 分 别是胰岛素A 链和B 链及其N a + 和氰脲酸的修饰物，仅有4 号峰为胰岛素，且和天然胰岛素在R P L C 的 保留时问相同。但是，4 号峰太小了，所以采用普通流动相时还原变性的牛胰岛素二硫键基本不能正 确配对，不能使其折叠复性。 通常还原的二硫键需要在
6、氧化剂存在下才可以进行正确配对。实验中在离子交换流动相中分别 加入一定比例的氧化还原试剂对，如G S S G G S H 、半胱氨酸C y s t G S S G ，C y s t 等，详细考察了它们 对还原变性牛胰岛素二硫键对接的影响，结果表明当C y s t G S S G 的比例为6 ：l 时( 流动相2 ，A 液：2 0 m m o l L 。1T r i s + 1 8m m o l L 1C y s t + O 3m m o l L G S S G ，p H8 0 ； B 液：2 0m m o l L 1T d s + 1 0m o l L 。I N a C I + 1 8m m
7、o l L IC y s t + 0 3m m o l L G S S G ，p H8 o ) ，还原变性牛胰岛素二硫键的正确对接率可人 第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 人的提高f 幽1 - 2 中色谱峰4 所示1 。 为了进一步减少还原变性蛋白在色谱柱上的聚积沉淀，增人浒c 动相的洗脱能力除在流动相中 加入c y $ V G S S G 外，还在B 液中加入8 0 t o o lL 1 脲，研究了脲梯度对折叠效率的影响结果发明采 川脲梯度洗脱( 流动相3 A 液：2 0 m m o i 0 I “ ir i s + l8 m m o lLC y s t + 0 3 m m
8、o l I jG S S G p H8 0 ； B j 匿：2 0 m m o l 0 T r l s 十l0 t o o lLo N a C 4 - 8 t o o l oo U t e a + I8 m m o lL 。C y s t + O3 m m o lL 1 G S S G p H 8 0 ) ，收集胰岛素离子交换色谱馏分井川R P L C 进行分离，结果如幽1 - 3 所示，该图中各色谱馏分1 “ - 8 ” 的M A L D | T O F M S 结果如图2 所示。从图2 可知圈1 - 3 中的l ”和4 ”的分子监分别为5 7 3 6 D 和 5 7 3 5 D 。色谱峰4
9、 ”与天然胰岛索的标留时间相同，而色谱峰l ”的分r 量虽然与天然胰岛景相同，但 其保留时间却与天然胰岛素不同。这说明采川脲梯度洗脱方式不仅可抑制还原变性胰岛素的聚积 而且增大了流动相的洗脱能力，使更多的胰岛索A 链和B 链接触而使其链问的二硫键得以正确配对， 其探留时问不同说明折叠后帕胰岛紊柏分子构象乖J 式然麟岛索还存盘的差异，还没有完全折叠成其 凡然构壤。但是住此条什F ，还原变性胰岛素二硫键的正确对接牢得到了人人提高。 ，w 7 M i # s c h - “ 即删离子变慢色培智募野藁色。鼢“眦地 陆岔1 计备鬯啪丹的”枷1 书F M 8 1 # “lt m 自目2 ：3 * 自牺 M_“；0 L ， m 州 ： jm凡， * “ M ，”F i ” ，j r，1I ?口 ，i 黼一 i 0 8口jj；M
