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1、禽类传染病 染病病原的精确定位和动态分布以及发病机理的研究。 3 2 何启盖等”1 报道，雏鸭感染D H v 强毒后，死前从肝脏和肠道检测不到D H V ，只有 死后才能检出。汪铭书等例发现从感染后末出现症状和未死雏鸭的肝脏和直肠粪便中没有 检测到D 。而出现症状和死亡雏鸭的肝脏和肠道均可检测到D H v 。程国富等应用单壳 隆抗体P A P 法对人工感染鸭肝炎病毒雏鸭的组织切片进行免疫组织化学原位染色观察， 感染后3h ，雏鸭心、肝、脾、肾、胰、腿部肌肉、脑组织细胞的细胞质内均出现有病毒抗 原，并且感染后1 6 8 h ，胰脏组织中仍有病毒存在。本研究从试验感染雏鸭各组织器官中D H v 抗
2、原动态检测结果可以看出，D H V 侵入雏鸭机体后最先在肝细胞检测到，其后是从肾脏、 脾脏、小肠、胰脏等组织细胞中检测出，最后是从心肌和脑组织细胞中检测到D H v ，这一 结果与所报道的免疫荧光测定、运用组织匀浆结合病毒滴度测定及应用单克隆抗体P A P 法 测定结果一致。本研究还发现在胸腺、法氏囊和哈氏腺均有棕黄色的I I s 染色产物，这是在 以前的报道中所没有的。 3 3 感染途经不同。3 个组各组织检出的时间顺序略有不同，感染速度，肌注感染 口服感染 滴鼻感染，由此可见肌注组的潜伏期要比口服组和滴鼻组短，但同时病毒出现感 染分布高峰期也比口服组和滴鼻组早，病毒通过肌注注射感染后在机体
3、各组织中的分布速度 最为迅速。经I I S 检出的时间顺序，肌注组：肝脏、脾脏 肾脏、十二指肠 胰腺、肌肉、 空肠 心脏、胸腺、法氏囊、哈氏腺、回肠、盲肠、直肠 肺、脑；口服组：肝脏 脾脏、 肾脏 胰腺、胸腺、哈氏腺、法氏囊、肌肉、十二指肠、空肠、回肠、直肠 盲肠 心脏、 肺脏 脑；滴鼻组：肝脏 脾脏、肾脏、肺脏 胰腺、法氏囊、十二指肠、空肠 胸腺、哈 氏腺、肌肉、回肠、盲肠、直肠 心脏、脑。各组织之间病毒含量的比较，3 个组均是肝脏、 脾脏、肾脏和肌肉阳性检出率最高，小肠、大肠、哈氏腺、法氏囊、胸腺、心脏次之，肺和 脑的阳性检出率最低，感染后6h ，滴鼻组的肺偶尔可见被病毒感染的细胞，肌注组
4、和口服 组在雏鸭出现死亡的部分对问点才能看到被病毒感染的细胞，脑是出现死亡的部分时问点能 够检出病毒抗原。H w a l l g 等”“运用组织匀浆结合病毒滴定法研究表明，病毒存在于感染鸭 的脑、肺、心、肝、脾等器官及腿部肌肉中，其中肝、脾含毒量最高，心、脑、肺次之，本 实验结果与该结果相似。 3 4 本研究发现几乎所有的雏鸭临死前都出现身体侧卧，两脚痉挛性划船状踢踏，死亡 时表现为角弓反张的神经症状姿势组织病理学观察未发现非化脓性脑炎的症状，只有明显 的毛细血管充血、出血等症状。对脑组织病毒抗原的检测，只有部分死亡雏鸭可检测到病毒 抗原，死亡前未检测到病毒抗原，这就不能证实神经症状的出现是病
5、毒直接损伤的结果。而 毛细血管的充血和组织的出血足以压迫神经。产生神经症状。 参考文献略 间接免疫酶染色检测I 型鸭肝炎病毒 陈海军。程安喜t2 一，汪铭书2 7 一一。陈孝跃 ( 1 四川农业太擘动物科技学院禽藕防治研究中心，四川雅安6 2 5 0 1 4 ：2 动物疲病与人类健康四川省 重点实验室，四川雅安6 2 5 0 1 4 ) 擅要本文以蔗糖密度梯度离心提纯的l 型鸭肝交璃毒( D H v I ) 免疫兔制备兔抗D H v I 抗体，建立 了问接免疫酶染色( I n d i 嘣I I I 曲u n 叩e r 慨i d a 辩s t a i n i I I 舀I I s ) 检测石蜡组
6、织切片中的D H v I 抗原的方法，并 时D H V I 强毒人工感染无亡或濒死雏鸭的各个蛆炽器官进行检洲结果表明建立的l l S 与D H v I 感染无 亡或濒死雏噶的肝脏等出现阳性反应与鸭瘟藕毒鸭疲里跤氏杆茸，走肪抒茵，沙门氏茸多杀性已氏 杆菌卷染发病和死亡雏鸭的肝脏以夏健康雏鸭的肝脏出现阴性反应感染D H v - l 死亡或濒死雏鸭的肝脏、 脾脏肾脏心脏、胸腺、法氏量胰腺，十二指脑盲腑空肠回肠、直肠免疫组化检测呈阳性或强 阳性D H V - I 抗原主要分布于感染细胞的细胞质谊法具有良好特异性可用于D H v - l 在感染雏鸭组织 细胞中的亚知胞定位。D H v - J 感囊雏鸭的
7、实验室诊断，甲醛固定组织的回顾性诊断。 为通讯作者 7 4 8 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 关键词免疫组化；检测；鸭肝克病毒；鸭；抗原定位 I 型鸭病毒性肝炎( D u c kv i m sH e p a t h i st y p e1 ，D v H - 1 ) 是雏鸭的一种急性致死性的、 传播迅速的病毒性疾病，以肝炎为主要特征”目前世界上所有主要养鸭地区均有本病 存在是危害养鸭业最为严重的疾病之一给养鸭业带来极大损失和严重威胁。弄清D H v I 在感染雏鸭体内的浸染规律和D H v I 在感染细胞内的位置，是阐明D H v I 致病机理的 重要基础，从而为制定有效预
8、防D 、m 的措施提供科学数据。根据流行病学特征、临床症状 和病理剖检可对D v H 做出初步诊断，确诊所需的诊断和检测的方法包括电镜检测p J 、中和 试验H 5 】、血凝试验【“”、荧光杭体【“、E L I s A 胁”等。这些方法在用于D H v I 的诊断与检 测时有其各自的优点，但却不能用于D H v - I 感染的组织器官和细胞的抗原定位检测和直观 判断。由于免疫酶组织化学( I m m u n o P e r o x i d a s t a i n i n g I s ) 检测具有直观和敏感的特点， 通过普通光学显微镜即可判定结果，在人类肿瘤等检测中得到广泛使用，但应用于动物医学
9、 研究中的报道相对较少”。本研究旨在建立一种检测D I 免疫组化方法为D H v _ I 感 染的实验室诊断、感染雏鸭体内的D H v I 抗原驻细胞定位的研究提供有效的实验检测手 段，为阐明D H v - I 致病机理提供科学数据。 l 材料与方法 1 1 实验毒株 D H V I 强毒株由四川农业大学禽病中心分离、鉴定和保存；D H v I - T 8 0 弱毒株由四 川农业大学禽病中心分离、鉴定、培育和保存。 1 2 实验动物 D H V I 抗体检测阴性的1 日龄雏鸭、2 3K g 健康公兔均由四J I I 农业大学实验动物工程 技术中心提供 1 3 主要试剂 辣根过氧化物酶偶联山羊抗
10、兔k G 、供体马血清、D A B 显色试剂均购自华美生物工程公 司 1 4 兔抗D 讧I I g G 的制备与纯化 将蔗糖密度梯度离心纯化D H v I - T 8 0 抗原，磷钨酸负染，电镜检测。按照参考文献l l l 】 方法四次免疫家兔，制备血清。用辛酸一硫酸铵法粗提抗体，再进行H i g hQ ( B i o R A D ) 离子 交换层析，得到较纯的D H v - I - I g O 。 1 5 免疫组化条件的优化 参照文献【1 1 ：”】， 以随机组合的方法对以下各因素作免疫组化条件优化。( 1 ) 固定液：A 为1 0 0 m l 几缓冲福尔马林溶液，B 为4 0 9 ，L 多
11、聚甲醛液： ( 2 ) 粘片剂选择：A 为A P E s3 7 烘 烤过夜，B 为A P E s6 0 烘烤2 h ；( 3 ) 甲醇- H 2 0 2 常温孵育时间和浓度：A 为3 m 儿H 2 0 2 处 理3 0 m i n ， B 为3 0 m I 几H 2 0 2 处理2 0 m i n l ( 4 ) 抗原修复所用方法：A 为0 0 l m 0 1 ，Lp H 6 O 柠檬酸 缓冲液微波修复1 0 m m ，自然冷却，B 为l m o 儿盐酸水溶液6 0 3 0 m i n c 为胰蛋白酶处理， D 为不修复处理； ( 5 ) 洗涤液：A 为0 0 l m o I ，Lp H 7
12、4P B s B 为含有0 5 m l 几T w e c n 2 0 的 O 0 l m o l 几p H 7 4 P B S ；( 6 ) 封闭液：A 为1 0 0 m l ，L 马血清，B 为1 0 0 叽B s A ；( 7 ) 一抗的稀释 度分别以l ：2 5 、1 ：5 0 、1 ：1 0 0 、1 ：2 0 0 进行孵育：( 8 ) 一抗孵育时间的确定：A 为4 过夜，B 为3 7 l h ：( 9 ) 二抗的稀释度分别以1 ：1 5 、l ：2 5 、l ：5 0 、l ：1 0 0 进行孵育。 1 6 结果的判定 判断标准：按照光学显微镜视野下观察到的特定细胞经染色后棕黄色显色
13、的有无、数量、 种类及深浅来判定。没有出现棕黄色细胞的判为阴性；组织中棕黄色细胞零星分布且少 于5 的判为弱阳性 组织中棕黄色细胞分布比例为5 5 0 为中等阳性；组织中棕 黄色细胞在组织中分布比例大于5 0 为强阳性。 1 7 特异性试验 7 4 9 禽娄传染病 1 7 1阴性和阳性对照 阴性对照为正常健康鸭组织切片；阳性对照为已知阳性的D H v I 感染发病死亡的雏鸭 各器官组织。 1 7 2 吸收试验 用D H v I 抗原与制备的兔抗D H v II g O 抗体等量混合，3 7 孵育2 h ，8 0 0 0r m i n 离 心1 5m i n 取上清代替兔抗D H v II g
14、G 抗体进行免疫组化实验。 1 7 3 替代实验 非免疫兔：常血清替代兔抗D H v - II g G 抗体，或省略其中任何一种免疫试剂，以P B s 代替，分别孵肖切片。 1 7 4 对其他病原人工感染袭死鸭的组织检测 应用建立的方法对鸭瘟、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌感染 发病和死亡雏鸭的肝脏组织进行检测。 1 8 免疫组化对D v I 感染病铡的检测 将4 0 只1 日龄雏鸭分成两组。一组注射P B S 作对照，一组每只肌肉注射1 0 3 L D D H v I 强毒，注射后观察发病和死亡情况，将濒死或死亡2 小时以内的鸭采集心、肝、脾、肺、 肾、脑、胸腺、胰腺、法
15、氏囊、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠各2 份，分别用1 0 0 m l ，L 缓冲福尔马林和4 0 9 屯多聚甲醛固定，按照常规方法进行酒精梯度脱水、石蜡包埋f 1 J 】。制 作4 微米切片用建立的方法进行检测和判定。 2 结果与分析 2 1 免疫组化检测D v I 抗原的建立和优化 实验结果表明采用以下技术程序可获得良好的免疫组化检测效果：( 1 ) 4 呛，L 多聚甲醛 作固定剂组织形态完整，抗原分布在特定位置。在3 7 烤片1 2 h ，6 0 再烤片1 5 m i n ，很少 掉片。将切片在二甲苯6 中脱蜡1 0 m i n ，二甲苯0 中脱蜡5 m i n ，无永乙醇$ 中3 m
16、 i n ，无水乙 醇0 中3 m i n ，9 5 乙醇中3 m i n ，8 0 乙醇中3 m i n ，7 0 乙醇中3 m i n ，5 0 乙醇中3 m i n 。( 2 ) P B S 中洗涤5 m i n 后，用3 0 m l ，L 的甲醇H 2 0 2 滴加在切片上室温下在湿盒中孵育2 0 m I m ，可消 除内源性氧化物酶引起的假阳性。( 3 ) 用0 0 l m o l 几的柠檬酸( P H 6 O ) 微波修复1 0 m i n ，自 然冷却至室温。( 4 ) 用含有O 5 m 】LT w e e n - 2 0 的O 0 1 m o 儿p H7 4 P B s 洗涤5 分钟3 次，背景 染色无或弱。( 5 ) 1 0 0 m l ，L 马血清或1 0 0 班B S A 湿盒中3 7 孵育
