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1、浙江大学 博士学位论文 间充质干细胞体外调控脐带血造血前体细胞增殖和分化的研究 姓名：岑洪 申请学位级别：博士 专业：内科学（血液病） 指导教师：林茂芳 20040201 浙江大学博士学位论文 间充质干细胞体外调控脐带血造血 前体细胞增殖和分化的研究 浙江大学医学院内科学( 血液病) 2 0 0 1 级博士研究生岑洪 导师林茂芳教授 中文摘要 骨髓组织中至少含有两种类型的干细胞：造血干细胞( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l ，t t S C ) 和间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l ，M S C
2、 ) 。骨髓造血微环境为H S C 提供生长、发育的 场所。造血微环境细胞成分主要由骨髓M S C 分化产生的成纤维细胞、脂肪细胞、成骨细胞和 内皮细胞等基质细胞构成。基质细胞通过与造血细胞直接接触、分泌细胞外基质及多种细胞 因子调控造血，维持造血微环境的结构和功能完整性，实现对造血的精细调控，维持骨髓正 常造血。M S C 作为造血微环境主要细胞成分的前体细胞( P r e c u r s o r ) ，具有自我更新和多向分 化特性，在造血微环境和造血调控中发挥重要作用。近年来有报道M S C 与H S C 联合移植能 够促进H S C 的植活率，缩短无髓期，减少死亡率。但目前对M S C
3、与造血调控之间的关系所知甚 少。本研究的目的，是探讨M S C 是否能在体外调控造血，以及如何调控造血。本研究分为三 个部分：一、脐带血造血前体细胞在间充质干细胞微环境中向单核系分化。二、可溶性MC S F 受体( s M R ) 的克隆、原核表达和功能测定。三、脐带血造m 前体细胞在间充质干细胞微环 境中的增殖动力学研究。 第一部分的研究中，采用F i c o l l 密度梯度离心，得到低密度的骨髓单个核细胞，然后 利用M S C 的粘附特性来分离纯化M S C 。实验中观察到原代培养接种的细胞于3 4 h 后开始贴 壁，2 4 h 后贴壁细胞数量明显增多，3 4 d 出现一些集簇。此时，细
4、胞多为梭形。一周后，贴 壁细胞体积增大，大部分呈梭形，有些细胞呈三角形或多角形，两周后，细胞铺成单层，排列 成漩涡状、网状、辐射状，其形态与成纤维细胞相似。在原代培养中。还观察到一些圆形的 造血细胞或内皮细胞贴壁生长，但经过传代培养后，这些细胞不能再次贴壁，贴壁的均为梭 形细胞，因此M S C 得到纯化。利用流式细胞术检测体外培养的M S C 纯度结果显示，M S C 均 表达C D 2 9 ( 9 9 7 ) 、C D 4 4 ( 9 9 1 ) 和C D l 6 6 ( 8 3 2 ) ，不表达C D 3 4 、C D 4 5 和H L A D R ， 表明培养的细胞为均一的M S C ，
5、无造血细胞污染。为证实体外培养的细胞是M S C ，须证明其 具有多向分化潜能。本研究通过添加成骨培养基和成脂肚培养基，诱导M S C 向成骨细胞和脂 肪细胞分化。M S C 经体外诱导培养三周后，通过R T P C R 技术检测证明有成骨特异性基因 3 浙江大学博士学位论文 ( 骨桥蛋白基因) 和成脂肪特异性基因( 脂蛋白脂肪酶基因) 的表达；通过V o nK o s s a 染色， 观察到成骨诱导培养后，细胞外基质有大量钙盐沉积，培养四至六周后油红染色，观察到成 脂肪诱导培养后，细胞内有大量的脂肪。表明M S C 已向成骨细胞和脂肪细胞分化，证实体外 培养的细胞是具有多向分化潜能的M S
6、C 。 为观察M S C 能否在体外调控造血，将脐带血单个核细胞接种到以M S C 为饲养层细胞的培 养体系中，经过2 - 3 周的共培养，观察到有大量的造血细胞粘附在M S C 上生长。流式细胞术 检测，发现该类细胞几乎都表达单核系标志C D l 4 ( 9 8 4 ) ，而不表达其它髓系和淋巴系标 志：C D l 5 ( 0 3 5 ，粒系) 、C D 4 1 ( 0 9 1 ，巨核系) 、g l y c o p o r i nA ( 0 2 8 ，红系) 、C D 7 ( 1 1 5 ，T 淋巴细胞) 和C D l 9 ( 0 9 1 ，B 淋巴细胞) 。说明在本研究的培养条件下，以M
7、S C 为饲养层细胞的微环境中，即使不添加外源性造血生长因子。脐带血造血前体细胞能向单核 系定向分化。国内外未见有类似的研究报道。此外，还观察到在向单核系分化的过程中，造 血细胞粘附在M S C 上生长，如果没有M S C 饲养层细胞，只用M S C 上清液培养时，细胞会逐渐 死亡。提示在向单核系定向分化过程中，除了造血生长因子的作用外，细胞与细胞间的相互 作用可能也是必须的。 已知与单核系定向分化有关的细胞因子有G M C S F 和M - C S F 。为探讨脐带血造血前体细 胞在M S C 微环境中向单核系定向分化的机制，检测M S C 中造血生长因子的表达发现其能构 成性表达S C F
8、 、F I t 3 L 和M - C S F 不表达G M C S F 和G - C S F 。巨噬细胞集落刺激因子( m a c r o p h a g e c o l o n y S t i m u l a t i n gf a c t o r ，M - C S F ) 是一种谱系特异性的造血生长因子，对单核一巨噬细 胞的增殖、分化及活性维持有重要作用。M - C S F 与巨噬细胞集落刺激因子受体( M C S F R ) 结合后，M - c s F R 发生二聚体化，其胞内区的激酶结构域活化，引发一系列的信号传递，从 而发挥其生物学效应。M - C S F R 是原癌基因( f m s
9、 ) 编码的跨膜蛋白。属于酪氨酸激酶受体家 族，其胞外区有5 个I g 样结构域分别称为D l 、D 2 、D 3 、D 4 和D 5 ，现已确定M - C S F R 胞外 区5 个I g 样结构域中的前3 个D 卜3 对M - C S F 的结合起直接作用。 为研究M s c 微环境中M c s F 对脐带血造血前体细胞增殖和分化的影响，第二部分的实验克 隆了M C S F R 胞外配体结合区( D 1 3 ) ( 可溶性M _ C S F 受I $ ，s M R ) ，通过它封闭间充质干细 胞分泌的M C S F 观察其生物学效应。参考文献报道的M C S F R 基因序列，设计了一对引
10、物 在上游引物中加入了限制性内切酶N d e I 的酶切位点，在下游引物中加入了B a I I l I I 的酶切位点 和终止密码子，扩增s M R 的基因序列，然后利用T A 克隆的方法，将其连接塑 p U C m T 载体上。 通过测序，证实了克隆的D N A 序列完全正确。再利用N d e I 和B a m 眦限制性内切酶分别切割携带 有目的基因的p u C m T s M R 质粒和表达载体p E T 2 8 a ( + ) ，分别回收目的基因和切开的线性 4 浙江大学博士学位论文 D E T 2 8 a ( + ) ，在T 4D N A 连接酶的作用下连接，得到了含目的基因的表达载体
11、p E T 2 8 s M R 。经I P T G 诱导后，1 h 即获得了很高的表达，2 h 已达高峰，表达产物为无活性的包涵体蛋白质。为得到 有功能的活性蛋白，须采用合适的复性方法促使变性蛋白再折叠而恢复活性。本研究通过稀 释，降低蛋白质浓度，采用逐步降低尿素浓度的梯度透析，并在透析液中加入还原剂G S T ， 对包涵体蛋白质进行复性处理，并对复性后的s M R 蛋白质进行功能检测，结果显示s M R 蛋白质 能与M C S F 特异性的结合，获得了具有功能的s M R 。 目前，控制脐带血造血前体细胞( 包括干祖细胞) 体外增殖和分化的机制还没有完全 被了解。只有充分认清造血细胞增殖的周
12、期动力学特性，才能有的放矢地建立最有效的造血 细胞扩增体系。第三部分的实验中，用M S C 模拟造血微环境，建立基于M S C 的体外造血细胞扩 增体系，系统观察在加入外源性造血生长因子( S C F 、F l t 3 L 、T P O 和I L 一6 ) 的条件下，脐带 血造血前体细胞在该体系中的增殖动力学特性。实验以单纯细胞因子组( C K 组，无M S c 饲养 层细胞) 为对照。结果显示，C K + M S C 组其扩增效率要明显高于c K 组( P 5 0 记为一个集落。H P P C F C ( 高增殖潜能集落形成细胞) ；直径 ：O m m 的粒单系集落。 C F C ( 克隆形
13、成细胞数) = C F U G M + B F U E + C F U E + H P P - C F C ，为所有集落的总和。 7 联苯胺染色 甲醇固定标本3 m i n ，弃甲醇，滴加1 联苯胺液染色3 m i n ，再滴加7 5 的H 。O ? 作用3 m i n ， 弃去染液t 蒸馏水洗两次，镜下观察结果，红系集落染成棕红色；粒单系集落染成紫蓝色。 8 细胞和集落计数校正公式 每周测定的单个核细胞和细胞集落数为校正后的总数，公式为校正后细胞数( 集落数) = 未校正细胞数( 集落数) - k ( 1 2 ) “，n T M 半量换液时丢弃细胞的次数”j 。 9 统计学分析 采用S P
14、S S 软件对实验结果进行单因素方差分析。 浙江大学博士学位论文 实验结果 1 造血细胞集落培养的镜下形态观察和鉴定 1 1 红系集落形态和鉴定 红系集落细胞体积较小，因为胞浆中有血红蛋白合成，集落可呈暗黄色( 图3 1 ) 联 苯胺染色后集落呈棕红色( 图3 2 ) 。 圈3 1 红系集藩形态( 倒置显微镜，来染色，x1 0 ) ) 图3 2 红系集藩形态( 僦置显微镜，联苯胺染色，x1 0 0 ) 4 9 浙江大学博士学位论文 1 2 粒一单系集落形态和鉴定 细胞体积较红系大，通常中央细胞致密，周边细胞散在( 图3 3 ) ：联苯胺染色后细胞 胞浆呈紫蓝色，容易与红系集落鉴别( 图3 4
15、) 。 图3 3C F U G M 集落形态( 倒置显微镜，耒染色，x10 0 ) 图3 4C F U G M 形态( 倒置显嫩镜，联苯胺染色，x1 0 0 ) 1 3H P P - C F C 集落 为粒单系集落，集落直径超过1 O m m ，细胞数大干5 0 0 0 0 个，集滔松散均匀，但有一个致 密的集落中心( 图3 5 ) 。 图3 5H P P C F C 集落形态( 倒置显傲镜，x1 0 0 ) 2 。脐带血造血前体细胞能在M S C 微环境中高效扩增 2 1 不同培养条件下脐带血造血前体细胞体外扩增能力的比较 脐带血单个核细胞( M N C ) 在培养第一周数量变化不明显。在单
16、纯细胞因子( c K ) 组， 细胞数减少，两在C K + A I S C 组和C K + M S C + s M R 组细胞数量略有增加；到培养第3 、4 周。细胞数量 迅速增加，C K + M S C 组和C K + M S C + s M R 组细胞数量明显高于单纯e K 组( P 0 0 5 ) 。由此可见，造血细胞在本研究的培养条 件下均能持续增殖，到第3 和第4 周时扩增能力迅速增加，在M S C 微环境中造血细胞扩增能力 要明显高于C K 组，加与不加s M R 组差别不大；到第4 周时，M N C 数量增加最高达1 2 0 5 7 倍( 与最 初接种的细胞数比) ；如图3 6 和表3 ，l 所示。 5 浙江大学博士学位论文 0 时间( 周) 4 4 7 8 2 1 一C K + I W S C + s M R I 卜C K + M S C 一C K 图3 6 不同培养条件下脐带血造血
