《长效尿酸酶（uricasepeg40kd结合物）的制备及基本性质研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《长效尿酸酶（uricasepeg40kd结合物）的制备及基本性质研究（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、p I I I 大学 硕士学位论文 题 只蓬垫丛墼堕【坠B 墨至：星9 4 Q K 坠鳖鱼堑2 煎剑墨丛墨查些煎盟窭 作者垂叁完成日期! Q Q ! 主! 旦2 Q 目 堵养单位 望纠盘芏圭全盘芏芏堕 指导教师垂堡垒垫挂 专业 生盐些芏当金主圭盐芏 研究方向 量鱼缝三堡量堕苎堡 授予学位日期 ；! ! ! 生目 四川大学硕士学位论文 申明 本人申明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文
2、中作了明确的说明并 表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四川大学所有，特此声明。 学位论文作者： 敝瓢节b 四川大学硕士学位论文 第一部分综述 ( P a r t1R e v i e w ) 随着生物技术的迅速发展，多种生物活性肽和蛋白质已作为药物被应用于 临床治疗疾病。但由于它们自身固有的结构特点，在体内存在半衰期短、易被 酶降解及免疫原性等问题。为了解决这些问题，科学家们从结构和制剂的角度 对其进行了大量研究，其中与天然或人工合成的聚合物( 如聚乙= 醇等) 偶联， 来改善多肽和蛋白质类药物的药理学和药代学性质，已发展成为一项重要的技 术。 化
3、学修饰作为提高多肽( 包括蛋白质) 、核酸和多糖等生物分子的临床和 生物学性能的重要手段得到了日益广泛的研究和应用。化学修饰的效果好坏很 大程度上取决于化学修饰的性能优劣。为此，化学修饰的合成近年来一直吸引 着世界范围生物、医学和化学工作者的研究兴趣。 迄今，已经有许多种类的修饰剂被相继合成出来。代表性的修饰剂有乙酰 咪唑、卤代乙酸、N 乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦炭酸二乙酯、四硝基甲 烷、N 卤代琥珀酰胺、乙二酸丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯 烷酮、乙烯顺丁稀二酰肼共聚物、多聚唾液酸、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精及 其衍生物、聚乙二醇( P o l y e t h y l e n e
4、O y c o l ，P E G ) 及其衍生物等。其中聚乙二 醇及其衍生物由于具有下述的优良性能而在化学修饰中应用最多：( 1 ) P E G 具有两亲性，既可以溶解于水，又可以溶解于绝大多数的有机溶剂；( 2 ) P E G 无毒，免疫原性低，其优异的生物相容性也已经通过美国F D A i X 证：( 3 ) P E G 的分子量范围宽，从几百到数十万，选择余地大；( 4 ) P E G 可以将它的许多优 良性质：如亲水性、柔性、抗凝血性、抗巨噬细胞吞噬性等等赋予修饰后的生 物分子。 在聚乙二醇的应用中，、端基起着决定性的作用，不同端基的聚乙二醇( 即 聚乙二醇衍生物) 具有不同的用途。在
5、实际应用中聚乙二醇高分子链端不仅仅 局限于羟基，其它反应性更强的功能化基团，如对甲苯磺酸酯基、氨基、羧基、 四川大学硕士学位论文 醛基等亦可被引入到聚L - - 醇链的两端。这些功能化集团的引入扩大了聚7 , - - 醇的应用范围，使它在有机合成、多肽合成、高分子合成及药物的缓释控制、 靶向施药等方面均具有广阔的应用前景。 一、聚乙二醇的特点及其应用 聚乙二醇由于其具有很多优良性质，因而广泛应用于生物、医药、卫生、 食品、化工等众多领域。在医药工业中聚乙二醇可用作药物辅料以提高药物的 各种性能，如分散性、成膜性、润滑性、缓释性等：在新型生物材料的合成和改 性中，聚乙二酵作为材料的一部分，将赋予
6、材料新的特性和功能，如亲水性， 柔性、抗凝血性等：在生化研究中，聚乙二醇可应用于蛋白质沉淀、细胞融合等。 聚7 , - - 醇衍生物的制备使P E G 带有反应性更强的功能化基团，这些功能基团的 引入，扩大了聚乙二醇的应用范围，使它在有机合成、多肽合成、高分子合成、 蛋白质化学修饰、基因治疗及药物控释、靶向施药等多方面均具有广阔的应用 前景。 i 在非病毒基因载体方面的应用 基因转染载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体虽然转 染效率高，但安全性存在隐患且有免疫原性，体内不能反复应用。非病毒载体 是病毒载体的重要补充途径、一般认为较安全，免疫原性低，而且是基于质粒 的转染、易于组装
7、。如今非病毒载体已是体外基因转染的主要手段。 非病毒载体通常是利用多价阳离子聚合物或脂质体来包裹质粒D N A 或反 义寡核苷酸形成复合物，通过表面多余的阳离子电荷与细胞表面的阴离子粘蛋 白结合，然后被动吞噬到细胞内，转入细胞核表达。近年来多种非病毒载体相 继问世，1 9 9 5 年B o u s s i f 等首先报道了聚乙烯亚胺( P E 0 可作为非病毒载体，其后， P E I 成为非病毒载体研究最快的领域。P E 弹体( - C H 2 C H 2 N I t 2 - ) 中每三个原子 含一个氨基，富含阳离子，有较强的结合D N A 和粘附细胞的能力。 尽管体外试验用P E I D N
8、 A - 转染真核细胞取得了长足的进展，但最终目的是 体内基因治疗应用。与体外细胞转染相比，体内应用面临着一系列问题：P E T 具有一定的细胞毒性，在胞液中的溶解性不好，在体内与体液和胞外基质相互 作用，由于其表面带阳性电荷，容易与血液体液中富含阴离子的大分子相互作 用，从而导致其转染效率降低。克服这些缺陷的有效的方法之一是利用聚乙二 醇衍生物对P E l 基因载体进行化学修饰。 2 婴型奎兰堕主兰竺堡苎 经P E G 修饰后，P E ) N A 可形成囊泡状结构、屏蔽表面多余的正电荷，有 利于体内应用，且可以增加P E I D N A 转染颗粒的可溶性。P E G 化的P E I D N
9、A 复 合物减少了转染颗粒之间的相互聚集及降低复合物与血清蛋白、红细胞之间的 相互聚集，延长了在血液中的循环时间并且降低了细胞毒性。K i r c h e i s 等用P E G 修饰T r a n s f c r r i n - P E I D N A 作动物体内全身应用，转染肿瘤坏死因子f I N F - a ) 的基 因。研究表明表达质粒可在肿瘤组织优先高效表达，抑制肿瘤生长，诱导肿瘤 局部出血坏死，而无明显细胞毒性。 聚乙二醇衍生物在P E I 载体领域的另一个用途是作为P E I 合成的交联剂。高分 子量的P E l 虽然具有较高的基因转染效率，但其细胞毒性也高：两低分子量P E I
10、 无毒。这样利用水溶性的可降解的P E G 衍生物作为交联剂，使低分子量的P E I 聚合为高分子量的P E I ，通过这种方法合成的非病毒载体既无毒又具有较高的转 染效率且P E G 改善了P E I D N A 复合物的水溶性。 i i 在药物控释和靶向方面的应用 P E G 衍生物因其优良性质非常适合于作为药物的载体。药物分子偶联到可 降解的P E G 分子上，在体内随着P E G 的逐渐降解，达到药物缓释的目的，延长 了药效持续时间。多种药物与P E G 衍生物偶联，如普鲁卡因、阿托品和各种水 杨酸盐类药物，所形成的复合物显示出预期的功效。还可以利用双功能P E G 衍 生物，使其一端
11、与药物分子连接，另一端偶联上靶向分子，既能够实现药物缓 释，又增强了药物的靶向性。 i i i 在蛋白质化学修饰方面的应用 a ) 蛋白质化学修饰概述 近年来，随着基因工程和蛋白质工程研究工作的深入开展，人们对蛋白质 及多肽类药物的需求与日俱增，尽管人们在生化药物研究领域取得了长足进步， 但随之而来的是蛋白( 多肽) 类药物的诸多弊病，例如半衰期短，有免疫原住， 易被蛋白水解酶降解，溶解性差等。 针对这些问题，研究人员提出了下述解决方案：( 1 ) 通过基因工程方法改变 蛋白质或多肽的氨基酸序列以降低其免疫原性，减缓蛋白质降解速度：( 2 ) 与免 疫球蛋白和血清蛋白结合，如白蛋白：( 3 )
12、 改进药物释放途径以达到缓释的目 的：( 4 ) 与天然或人工合成的高聚物结合。 其中比较常用的方法是用天然或人工合成的高聚物对蛋白质分子进行化 学修饰。从广义上讲，凡是通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构 四川I 大学硕士学位论文 发生改变的方法都可称为蛋白质的化学修饰。酶的化学修饰已有几十年的历史， 起初人们致力于小分子化合物修饰酶分子中氨基酸侧链基团来研究一些酶的活 性位点，得到了许多有价值的数据，为酶结构与功能的关系研究以及酶催化机 理研究作了许多有益的探索。后来认为为了消除某些蛋白质的抗原性，用聚丙 氨酸进行修饰，结果发现其抗原性显著降低，并从中得到了很大的启示。于是， 研究
13、者们相继开发了多种酶化学修饰方法，用以改善酶的性质。可以用来进行 化学修饰的修饰剂有很多，既包括一些小分子，也有一些大分子如多肽和聚乙 二醇等。f 1 2 0 世纪7 0 年代开始，酶化学修饰技术一直是酶工程中一个非常活跃 的研究课题，文献报道很多。 b )蛋白质的P E G 化 聚乙二醇对蛋白质的化学修饰己被证明具有颇多优点，通过对蛋白实施 P E G 化，降低了免疫原性与抗原性，降低了其体内清除的速率，延长了其在体 内的半衰期，增加了蛋白质的溶解性，增强了蛋白质的物理学和热力学稳定性 以及抗蛋白酶降解的能力，维持蛋白质活性，从而加强了药物蛋白的疗效。1 9 9 1 年，第一个聚7 , -
14、- 醇修饰的蛋白质类药物一聚7 , - - 醇修饰的腺苷脱氨酶 ( P E G - A D A ) ，获得美国F D A 批准在临床上治疗由于该酶缺陷而造成的严重综合 免疫缺陷症( S O D ) 。 原理和方法： 蛋白质的免疫原性由分子表面的抗原决定簇决定。P E G 是一种线性、亲水、 灵活且不带电的分子，当它与蛋白质的非必需基团共价结合时，可作为一种屏 障，挡住蛋白质的抗原决定簇。使该蛋白作为异源物质不会被识别，避免相应 抗体的产生或者阻止抗体与抗原的结合从而抑制相应的免疫反应。这便是P E G 降低蛋白质免疫原性的基本原理。也正因为这一屏障，避免了蛋白酶对蛋白的 降解。另一方面，酶蛋白
15、的底物往往是一些小分子它们可以穿过P E G 分子所形 成的屏障与蛋白质的活性部位接触，使酶促反应得以进行。所以，P E G 化不会 显著影响酶的活性。P E G 化还可以增大多肽及蛋白的分子尺寸，减缓肾小球过 滤，改变其在体内的分散性等，从而延长了半衰期。 现普遍采用的是单甲氧基聚7 , - - 醇( 简称m P E G ) C H 3 0 ( C H 2 C H 2 0 ) 。H ，其 中n 一般从1 0 至4 0 0 不等。在水溶液中，每个氧乙烯基团可结合三分子水。在蛋 白质P E G 化的过程中，P E G 末端的羟基是其化学反应的功能基团。但它反应活性 低，只能在较激烈的条件下与其它
16、基团发生反应，而这样的条件常常为蛋白质 4 四川大学硕士学位论文 所不能耐受。因此，必需将P E G 改造成各种活性中间体，以便在温和的条件下 以较高的反应速率与蛋白质相偶联。这便是P E G 的活化。 活化的P E G 可通过与蛋白质的分子侧链上的各种化学基团反应而与蛋白质 分子相偶联。目前蛋白质分子上用于与P E G 进行偶联的基团主要是氨基，巯基 和羧基。 ( 1 ) 氨基修饰：由于氨基( ) b L y s 的e - N H 2 ) 往往存在于蛋白质分子表面，加 之较高的亲核反应活性，使之成为目前蛋白质P E G 化中最常用的被修饰基团。 氰肼酰氯法是经典的P E G 活化方法。N 羟基琥珀酰亚胺活性酯法发展较晚，但 此法由于修饰的蛋白质活性保留好而逐渐流行起来。下图所示为P E G C S 修饰蛋 白质氨基的反应。 g ，。昏。卜 N H i p r d e i q ，椎。- j k 。，。d 。 矿 o P E G C s 修饰蛋白质氨基的反应 用此法修饰超氧化物歧化酶( s o o
