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1、 嘌呤类药物作用及巯基嘌呤甲基转移酶遗传多态性的研究进展 目前研究结果表明,治疗急性淋巴细胞白血病的抗嘌呤代谢药物6-巯基嘌呤和6-巯代鸟嘌呤均是无内在生物活性的药物,必须通过体内一系列代谢后才能发挥抗白血病效应。而人体一种被称为巯基嘌呤甲基转移酶的代谢酶在此类药物代谢和抗白血病作用中起关键作用。此酶是存在于哺乳动物和禽类细胞中的一种细胞内酶,非金属依赖性,能利用S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基的供体和底物结合,特异地催化杂环类和芳香类化合物苯环6-位硫原子的甲基化,其内在底物和主要的生物学功能仍然未完全清楚1，2，而其DNA编码顺序上某个核苷酸碱基点突变,是造成嘌呤类药物不同强度的细胞毒作用的
2、基础3。所以,对于TPMT酶学特点、其遗传多态性的分子生物学机制以及6-MP、6-TG临床关系的研究成为当前研究药代动力学的热点之一。 16-MP和6-TG的代谢4，56-MP的代谢途径：由次黄嘌呤磷酸核糖转移酶催化先形成硫基次黄嘌呤单磷酸盐,硫基黄嘌呤单磷酸盐,硫基鸟嘌呤单磷酸盐,后者经磷酸化后分别形成二磷酸盐和三磷酸盐。后三种物质统称为TGNs,它整合到肿瘤细胞中影响DNA的复制及RNA的表达,发挥抗肿瘤作用。6-MP,TIMP,TGMP均可由TPMT催化生成甲基化的衍生物6-meMP,6-meTGMP,6-meTIMP,这些甲基化的化合物属于“无活性”的物质,它们能够抑制磷酸核糖焦磷酸化
3、氨基转移酶的活性,后者是细胞重新合成嘌呤步骤中的关键酶,因此,抑制PRPP-AT的活性就阻断了肿瘤细胞遗传信息的表达,从而达到抗白血病的作用。由黄嘌呤氧化酶催化形成6-硫基黄嘌呤后再形成尿酸也可生成尿酸排出。 6-TG的代谢途径：由HPRT催化直接形成硫基鸟嘌呤磷酸化合物发挥抗白血病作用。也可由TPMP催化生成甲基化的产物如6-meTG,或me-TGMP,达到抗肿瘤的作用。但组织中TPMP对6-TG的催化效力远比6-MP低4，故此过程并非6-TG的主要代谢途径。6-TG由鸟嘌呤脱氢酶催化生成6-硫基黄嘌呤再由黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸排出。 2TPMT的酶学特点 TPMT的组成结构：由两个具有相
4、同的催化功能单体组成,说明TPMT的结构并非引起遗传多态性的原因。TPMT的分子量大约为30000。通过提取和分析人肾脏组织中的TPMT,发现它由245个氨基酸残基组成。另有人还发现几乎每个依赖SAM的甲基转移酶均含有3个结构保守的序列，分别含24-，12-，12-三个单体结构,估计这些序列为酶结合底物的结构域68。 TPMT的组织分布：人类TPMT首先在肝脏、肾脏中被发现,随后陆续地在胃肠道、肺、脑、血液、胎儿、胎盘等组织中发现。成年人肝细胞的TPMT浓度和血液组织中几乎呈直线相关。第3个月的胎儿即有TPMT的存在,其中第6个月的浓度及活性和新生儿类似,说明TPMT的浓度及活性在人体各组织内
5、，甚至肿瘤组织中均存在密切相关性,测定红细胞中的TPMT浓度即可大致估计其它组织的酶活性9,10。 TPMT的酶学动力学特征：酶活性随孵育时间、底物浓度、pH值和离子浓度、底物浓度的变化而变化11。TPMT最佳孵育时间为60分钟10,其它参数符合Michaelis-menten曲线。同时,Krynetski等11发现在一般组织中酶作用最佳pH值为,而血液中为。 TPMT的底物及抑制物：Krynetski等做了18种6-MP和6-TG衍生物的酶学实验,包括它们的核苷酸和核糖核酸,描述了它们的反应特性：大多数的衍生物均可作为TPMT的底物,它们的酶促动力学特性均符合Michaelis-menten
6、曲线,发现6-MP比6-TG与酶结合的能力强。在所有前体药物和衍生物中,8-羟基-6-MP和6-TG分别是两个药物家系中活性最大者,而它们的核苷酸盐类则是这些化合物中活性最低的,其原因可能是它们较易被水解。Mcleod等10发现当化合物中7,9位被烷基化后,其与酶结合的能力有所加强。同时发现前体药物的Km、Vm和Km/Vm值均比其衍生物低,说明6- MP和6-TG并非TPMT的自然底物。另外,6-硒基嘌呤及其衍生物也可以作为TPMT的底物,但是它们的Km和Vm值均显著比硫基嘌呤及其衍生物低。黄嘌呤8位上有-OH基者是底物，而2位上有-OH则为抑制物12。除2-OH-黄嘌呤外,S-腺苷-L-半胱
7、氨酸、Sinefungin、6-甲基硫基嘌呤、3，4-双甲氧-5-对羟基苯甲酸为TPMT的抑制物2。 3TPMT的遗传多态性从人类T84结肠癌患者细胞中提取分析DNA及cDNA寡核苷酸探针筛查文库,发现TPMT基因总长为,编码序列总长,开放阅读框架含735个碱基。国外多个文献调查显示,大约有89%的人TPMT酶活性6U/ml pRBC,属于高活性,而11%的人酶活性为15U/ml pRBC,属于中度活性。而大约1/300的人活性低于1U/ml pRBC或其活性无法测出。造成这种结果的原因是编码TPMT的核苷酸碱基顺序发生点突变,而是否有染色体易位或丢失尚无文献报道。美国和英国学者已在白种人中发
8、现和克隆出两个点突变位点,分别命名为TPMT*2和TPMT*3。其中前者是核苷酸序列中第238位的鸟嘌呤胞嘧啶,使得氨基酸序列第80位的AlaPro,后者是第460位的鸟嘌呤腺嘌呤,第719位的腺嘌呤鸟嘌呤,结果是氨基酸序列第154位的AlaThr,第240位的TyrCys,这样就造成了酶活性的减低或丧失，从而导致在使用6-MP时形成高浓度的TGNs,引起明显的造血组织细胞毒性,产生严重后果,甚至引起死亡。两种突变类型中,TPMT*3出现的频率占两种类型的70%，而TPMT*2占30%13,14。 4影响TPMT活性的因素 种族特异性：美国弗罗里达州黑种人平均TPMT酶活性为/ml pRBC,
9、未发现缺陷患者。而白种人平均为/ml pRBC,酶活性的分布比例与前述类似15。Mcleod等16发现白种人的酶活性平均值为/ml pRBC,黑种人则为/ml pRBC。法国人平均/ml pRBC,其TPMT遗传多态性的分布和美国人相同1。新加坡的调查显示,健康华人中TPMT的多态性结论和美国人相似,而实际的数值却大大超过了国外报道的结果17。挪威Saami人的平均值为/ml pRBC,白种人为/ml pRBC,而酶活性的分布比例与前面结果相似18。同时,他们与韩国合作检测韩国人群的酶活性,其结果也类似19。 性别：3篇文献报告在白血病患者中女性的酶活性似比男性高,而健康人无明显差别5，8，2
10、0。其它的文献结果为无显著差异2，3，17。 年龄：文献提示TPMT的活性与年龄无相关性9。 红细胞寿命及免疫分型：无相关性11。 使用6-MP前后TPMT活性：患者在进行化疗时其体内TPMT的活性与用药前相比大约要上升30%,其中以用药前活性最低的患者上升得最快。而用药后约3个月又逐渐回到原来水平,其中下降得最快者是用药期间活性上升最高者5，11。 慢性疾病：无相关性11。 5TGNs和TPMT的关系TGNs和TPMT甲基化是嘌呤类药物治疗白血病的两个重要途径,它们之间的关系可以归结如下：高TPMT活性的人群形成的TGNs量少,甲基化产物多；低活性的人群形成的量多,甲基化产物少。因此,低活性
11、人群TGNs虽然能产生强烈的抗肿瘤作用,但同时也容易产生毒副作用,引起造血组织的致命损伤；而高活性的人群由于体内的TGNs量少,虽然此副作用弱,但出现复发的机率也大21。 66-TG和6-MP的临床关系由于6-TG直接衍生为TGNs,而且临床发现患者在使用6-TG时较少出现造血组织毒副作用及具较低复发性12下一页 ,因此,有人建议以它 替代6-MP。但6-TG可引起门脉高压，与别嘌呤醇合用时引发较高的毒性,而且价格昂贵、半衰期短,所以目前临床医生建议和6-MP按需选择性交替使用22。此外,6-MP和6-TG的作用机制也稍有不同,前者作用于细胞周期的G1/S期,而后者作用于S/G2晚期,6-MP
12、使嘌呤再合成受阻,而6-TG则使染色体“变性”,可能引起严重的治疗后期不良反应,故当患者酶活性低时可适当降低药物剂量,有文献报道将剂量降低90%时所产生的疗效和正常剂量无显著差异。另有文献报道酶活性低患者当降低6-MP剂量时如果和甲氨喋呤联用可产生较好的疗效。其机制为抑制嘌呤合成后产生大量磷酸核糖焦磷酸盐,后者可以整合到细胞DNA中抗肿瘤。而当患者酶缺陷时应大规模减少剂量或选择换用其它药物。由于大多数患者在治疗前其体内TPMT活性未知,因此,在用药时较难避免造血组织毒性,加大了治疗的难度及影响疗效。此外,输血可能造成测定时的误差,应引起注意23。 7研究嘌呤类药物和TPMT的意义进行此项研究的
13、意义在于：测定6-MP原发性耐药个体,避免患者对药物不敏感,造成维持治疗期的复发,贸然加大剂量同时也易产生毒副反应。测定TGNs浓度,避免高浓度时患者对药物过度敏感,产生造血组织抑制和肝脏损害,被迫终止维持治疗,使化疗不能长期、规则、正常地进行,从而容易复发。避免由于造血组织的毒性使得全身免疫能力下降,产生继发感染,引发死亡或其它严重的反应。因此,认识中国人6-MP药代动力学,深入研究TPMT表现型和基因型,了解其遗传多态性的分布和机制,掌握药物代谢过程中的各种数据,就可针对每个患者不同酶活性和TGNs而制定相应的用药方案,使治疗个体化,提高急性白血病尤其是ALL的远期疗效乃至提高长期无病生存
14、率。 参 考 文 献 1Tinel m,Berson A,Ersayre D,et of human erythrocyte thiopurine methyltransferase activity in French J Clin pharmac,1991,32:729-734. 2Loon VJA,Szumlanski C,Weinshilboum RM,et kidney thiopurine methyltransferase photoaffinity labeling with Pharmac,1992,44:775-785. 3Szumlanski C,Otterness D,
15、Her C,et methyltransferase pharmacologenetics:human gene cloning and characterization of a common Biology,1996,15:17-30. 4Evans WE,Relling vs thiopurine for the treatment of acute lymphoblastic res,1994,18:811-814. 5Lennard L, Lilleyman JS,Loon JV,et variation in response to 6-mercaptopurine for c hildhood acute lymphoblastic ,1990,336:225
