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1、苏州大学 硕士学位论文 造血干细胞移植早期细胞因子及血小板功能的相关研究 姓名：高海丽 申请学位级别：硕士 专业：血液病学 指导教师：孙爱宁;韩悦 20090501 造血干细胞移植早期细胞因子及血小板功能的相关研究中文摘要 造血干细胞移植早期细胞因子及 血小板功能的相关研究 中文摘要中又捅芰 目的：( 1 ) 探讨异基因造血干细胞移植早期T N F Q 、I L l B 、I F N - y 细胞因子的变 化规律，研究其在预处理过程中的变化情况，及其与急性移植物抗宿主病( a G V H D ) 、 血栓、感染病变之间的关系。( 2 ) 研究造血干细胞移植患者预处理前后血小板膜糖 蛋白与血小板
2、聚集功能的变化情况及其临床意义。 方法： 1 移植早期细胞因子检测 1 1 病例资料取自我院2 0 0 6 年6 月至2 0 0 8 年7 月之间的异基因造血干细胞移 植9 5 例，其中男6 5 例，女3 0 例，中位年龄为3 2 岁( 1 2 “ - - 6 0 岁) 。急性粒细胞性 自血病( A M L ) 2 8 例；急性淋巴细胞性自血病( A L L ) 2 4 例；慢性粒细胞性自血病 ( C M L ) 2 9 例；其余( 包括淋巴瘤、M D S 、A A 等) 1 4 例。同胞全相合造血干细胞移 植患者5 4 例，无关供体造血干细胞移植2 9 例，亲缘半相合移植1 2 例。根据移植
3、类 型预处理主要采取改良B U C Y ，T B I + C Y 方案。根据并发症的发生情况诊为急性移植 物抗宿主病组( a G V H D ) 4 3 例、血栓组( 包括T M A 、H V O D 、动静脉血栓) 5 例和 感染组3 1 例。 1 2 标本收集与细胞因子指标检测清晨空腹静脉采集移植患者的外周血，采集 时间为预处理前，预处理开始第4 天，预处理结束后至出院之间各周外周血标本，每 周一次。2 0 名健康成人作为对照。采用酶联免疫吸附法( E L I S A ) 检测预处理前后以 及移植后各周内T N F a I L l p 、I F N 吖血清浓度动态变化，观察预处理前后细胞因
4、子 的改变。 2 血小板膜糖蛋白和血小板聚集功能的检测 2 1 病例资料取自我院2 0 0 7 年8 月至2 0 0 8 年4 月的2 9 例造血干细胞移植患者， 男1 7 例，女1 2 例，中位年龄3 l ( 1 4 “ - - 5 5 ) 岁。急性淋巴细胞白血病( A L L ) 1 1 例， 造血干细胞移植早期细胞因子及血小板功能的相关研究 中文摘要 急性粒细胞性白血病( A M L ) 1 0 例，慢性粒细胞性白血病( C M L ) 3 例，其余5 例。同 胞全相合造血干细胞移植患者1 3 例，无关供体造血干细胞移植8 例，半相合移植4 例，自体移植4 例。移植预处理大部分采用改良B
5、 U C Y 方案，少量患者采取T B I + C Y ， 自体移植采取B E A M 方案。移植患者a G V H D 的预防均采用C S A + M T X 为主的方案， 无关或亲缘半相合患者在C S A + M T X 基础上加用A T G 或M M F 。 2 2 检测方法用流式细胞术观察血小板膜糖蛋白G PIb 、G P I I b 、G P I I I a 和 C D 6 2 P 在预处理前后表达的变化。使用二磷酸腺苷( A D P ) 诱导剂促进血小板凝聚， 应用血小板比浊测定法检钡, J J 2 9 名造血干细胞移植患者预处理前后的血小板聚集功能。 2 0 名健康人作为正常对照
6、。 结果： ( 1 ) 通过动态监测，预处理前T N F a 水平在a G V H D 组已经较正常升高( P O 0 1 ) ，移植后第1 、4 周升高更明显，其他患者中未见明显改变。在预处理第四天 后所有患者都较前明显升高( P 2 m g d l ( 3 4 2 u m o l L ) 且至少有以下3 条中的 两条肝肿大( 通常疼痛) ，腹水，体重增加超过原有的5 。 动静脉血栓的诊断标准： 采用美国医师协会( 2 0 0 7 ) 指南【4 】，对可能性属中度和高度的患者，, 行P T E J $ V Q 显像或C T P A 或肺动脉造影等检查，同时进行D V T 的彩超或C T V
7、或静脉造影等检查。 移植相关性血栓性微血管病变( T M A ) 的诊断标准： 依据欧洲血液和骨髓移植国际工作小组提出的诊断标准，满足以下所有条件的患 者可以诊断为T M A 5 】：外周血中 4 裂细胞新发或进展性的血小板减少( 5 0 x 1 0 9 L 或比以前计数减少5 0 以上) L D H 突然或持续升高H b 减低或血浆置换 需求增加血浆结合珠蛋白减低。 3 3 感染的诊断标准： 被限定为发热超过3 8 5 ，血、痰、尿等培养以及通过其他检查发现有阳性的 微生物学结果、影像学表现或临床上证实的感染或临床上怀疑的感染【6 】。 4 标本收集和处理 清晨空腹静脉采集移植患者外周血，采
8、集时间为预处理前，预处理开始第4 天，预 处理结束后至出院每周的外周血标本，同一患者再次住院的标本也同样收集在内，高 速离心后上层血清用消毒的无菌E p p e n d o r f 管一8 0 “ C 保存待测，两小时内标本处理完 毕。 5 主要试剂 ( 1 ) T N F 0 【抗原试剂盒上海太阳生物技术公司 ( 2 ) I L l p 抗原试剂盒上海太阳生物技术公司 ( 3 ) I F N - 7 抗原试剂盒上海太阳生物技术公司 6 仪器 ( 1 ) L D Z 5 2 低速平衡离心机北京医用离心机厂 ( 2 ) 低速离心机( K D C - - 4 0 )中国科大创新股份有限公司 造血干
9、细胞移植早期细胞因子及血小板功能的相关研究第一部分 ( 3 ) 台式高速离心机( T G L 1 6 G )上海医用分析仪器厂 ( 4 ) 漩涡振荡器上海医科大学仪器厂 ( 5 ) D K $ 1 2 型电热恒温水浴锅上海医疗器械五厂 ( 6 ) D G 5 0 3 2 型酶标仪上海佰申医疗仪器公司 ( 7 ) 低温冰箱S A N Y O ，日本 ( 8 ) 立式自控电热压力蒸汽灭菌锅( L D Z X 一4 0 S B ) 上海申安医疗器械厂 7 实验方法 7 1T N F 0 t 抗原的检测 采用E L I S A 双抗体夹心法，步骤如下： ( 1 ) 将存放于8 0 “ C 冰箱的待测标
10、本在3 7 的恒温水浴箱里迅速溶解待测。 ( 2 ) 标准品作6 次倍比稀释得浓度为1 0 0 0 、5 0 0 、2 5 0 、1 2 5 、6 2 5 、3 1 2 5 、1 5 6 2 5 p g m l7 个标准点。 ( 3 ) 加样：分别将不同浓度的标准品及待测标本( 1 0 0 u l 孑L ) 加入相应的孔中， 空白对照组加入样品稀释液( 试剂盒提供) 1 0 0 u l ，酶标板加上盖，3 7 孵育9 0 分钟。 ( 4 ) 洗涤：甩去酶标板内液体，用洗涤液反复洗涤3 次后拍干。 ( 5 ) 加生物素化抗体工作液：将准备好的生物素化抗T N F ( I t 抗体工作液按每孔 1
11、 0 0 u l 依次加入，3 7 “ C 孵育6 0 分钟。 ( 6 ) 洗涤：同( 4 ) 洗涤。 ( 7 ) 加A B C 工作液：将准备好的亲和素过氧化物酶复合物( A B C ) 工作液按每 孑L 1 0 0 u l 依次加入，3 7 孵育3 0 分钟。 ( 8 ) 洗涤：甩去酶标板内液体，对着吸水纸拍几下，用洗涤液反复洗涤5 次后拍 干。 ( 9 ) 显色：按每孑L 9 0 u l 依次加入已在3 7 “ C 平衡3 0 分钟的3 ，3 ，5 ，5 四甲基联苯胺 ( T M B ) 显色液，3 7 “ C 避光反应。反应过程中经常观察。 ( 1 0 ) 终止：当肉眼可见标准品的前3
12、 4 孔有明显的梯度蓝色，后3 4 孔差别不明 显时，即可加入T M B 终止液每：j ：l , 1 0 0 u l 。 ( 1 1 ) 比色：用酶标仪在4 5 0 r i m 处，以空白对照孔调零，测量各孔光密度值( O D 值) 。 1 2 造血干细胞移植早期细胞因子及血小板功能的相关研究第一部分 ( 1 2 ) 数据处理：用S P S S l1 5 软件以标准品浓度和对应的O D 值作出标准曲线， 根据标准曲线得出各样品T N F a 抗原的浓度( 敏感性 O 0 5 ) 。a G V H D 组细胞因子水平改变情况见表5 。 在a G V H D 组中，3 4 0a G V H D 组
13、较1 2 0a G V H D 组发病当周的I L l 。p 水平升高更加 明显( 尸 O 0 5 ) ，中位数值分别为8 0 2 9 ( 2 4 3 2 1 4 3 4 0 ) 与4 1 5 6 ( 2 8 3 3 1 2 5 2 5 ) p g m l 。 表5 a G V H D 组三种细胞因子的变化( 中位数及四分位数间距) 注：与正常对照组比较，P 0 0 1 ，尸 O 0 5 ；与预处理前比较，P 0 0 5 ；与 血栓组比较，V P 0 0 1 ；与感染组相比，P 0 0 1 5 血栓组细胞因子水平改变情况 血栓组患者预处理前三种细胞因子和正常对照组相比均无明显差异。发生血栓前
14、两周至发病当周T N F g 水平较预处理前均明显升高( 尸 O 0 5 ) ，和正常对照组相比也 有升高趋势。发病当时血清I L l p 含量明显高于正常对照组和移植预处理前水平( 尸 O 0 1 ，P O 0 5 ) ，且较a G V H D 患者升高更明显( 尸 O 0 1 ) 。其I L l p 水平于血栓发生 前两周较正常对照明显升高( 尸 0 。0 5 ) 。在发生血栓病变的5 名患者中，其中两例栓 塞病人( 肺栓塞和下肢静脉栓塞患者各1 例) 的血清I F N Y 含量极度升高，分别为8 8 6 5 p g m l 和9 1 6 3p g m l ，其余患者的I F N 吖含量较
15、低，各阶段水平变化不大。血栓组细胞 因子水平改变情况见表6 。 1 6 造血干细胞移植早期细胞因子及血小板功能的相关研究 第一部分 表6 血栓组三种细胞因子水平( 中位数及四分位数间距) 注：与正常对照组比较，P 0 0 1 ，P 0 0 5 ；与预处理前比较，P 0 0 5 ；与 a G V H D 组比较，。P 0 0 1 ：与感染组相比，P O 0 5 ，尸 0 0 1 6 感染组细胞因子水平改变 感染发生时T N F a 和I L l B 较正常对照组明显升高( 尸 0 0 5 ) ，低于a G V H D 和血 栓组。发病前两周的T N F Q 和I L l p 均无明显变化。感染组
16、血清I F N 一7 在预处理前和病 变发生各阶段均无明显变化。感染组细胞因子水平改变情况见表7 表7 感染组三种细胞因子水平( 中位数及四分位数间距) 注：与正常对照组比较，P 0 0 5 ； 造血干细胞移植早期细胞因子及血小板功能的相关研究 第一部分 7 移植过程中T N F 眠I L l p 在三组并发症中的动态改变 T N F - a 在三组并发症中的动态改变见表格8 ，移植前至移植后各周a G V H D 组患 者T N F 一0 【水平均明显升高，a G V H D 组移植前1 周，移植后第1 、4 周明显高于感染 组患者，和血栓之间的差别不明显，不同程度的a G V H D 之间无明显差别。血栓组于 移植后第3 周较感染组有升高趋势，其余时间未见明显差别；I L l 1 3 在三组并发症中 的动态改变见表9 ，a
