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1、石河子大学 硕士学位论文 通过棉花叶片水孔蛋白基因的研究提高棉花的抗旱性 姓名：祝毅 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：张煜星;祝建波 20100601 I 摘 要 水孔蛋白是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子的水通道蛋白，它大量存在于动物、 植物及微生物等多种生物中。 它所介导的自由水快速被动地跨生物膜转运是水进出细胞的主 要途径。 在植物发育过程中编码不同水孔蛋白的基因的表达与不同的生理过程相关， 包括气 孔的关闭、器官运动、细胞伸长以及细胞分裂，而且它还在植物种子萌发、韧皮部的装卸及 逆境应答等过程中调节水分跨膜快速流动， 因此植物水孔蛋白在植物体内形成水选择性运
2、输 通道，介导胞内或胞间的水分跨膜运输，调节植物体内的水分快速平衡，对于提高植物抗盐 及抗旱性可能发挥着重要作用。 根据目前国内外的研究状况，在棉花中只发现了两类水孔蛋白，分别是质膜内在蛋白和 液泡膜内在蛋白，其中质膜内在蛋白只是在棉花的根、茎和胚珠中发现有表达，而在叶片中 的表达量很少。而在本研究中，采用RT-PCR的方法，根据GenBank上公布的棉花水孔蛋白 基因序列设计引物，从棉花叶片中克隆得到了四个棉花质膜水孔蛋白基因，分别为 GhPIP1;1、GhPIP1;2、GhPIP2;1和GhPIP2;2，测序结果与公布序列的相似性都在99%以上， 氨基酸序列更是在99%以上。然后构建了植物
3、表达载体pBI121-GhPIP，通过农杆菌介导的方 式转化模式植物烟草，获得转基因烟草再生植株，经初步RTPCR分析证明转基因植株能 够正常转录。 本研究还分别选取四个基因的 300bp 做干扰片段用以构建 RNA 干扰载体，先构建好中 间载体，然后构建到表达载体 pCAM2300 上，用以对棉花胚性愈伤组织的转化。观察转化 的棉花愈伤组织的生长状况，然后测其愈伤组织的干重与鲜重比，对比对照组发现，对水分 的调控能力有所增强，这说明达到了干扰的目的，沉默了该基因，为以后进一步研究该类基 因打下基础。 关键词关键词：水孔蛋白，质膜水孔蛋白基因，RNA干扰 II Abstract Aquapor
4、ins refers to the water channel protein which lies on cell membrane and can selectively transfer water molecule effectively. It exists considerablely in many kinds of animals, plants,microbe,etc. The transfer of free water which idmediated by aquaporins between different biomembranes is the main met
5、hod of water in or out of cell. During the development of plant, gene expression of aquaporins with different code is connected with differnet physiological process, including the closeness of stomatal , the movement of organ, cell alongation and cell fission. Whats more, aquaporins can also control
6、 the movement of water molecule between different membranes during the process of germination of seed, loading and unloading of phloem and stress response, so the water-selected channel in plant formed bu the aquaporins plays an important role in mediating the flowing of water molecule in or between
7、 cells, controlling the balance of water in plant and improving the ability of anti-salt and anti-drought. According to the current research in and abroad, only two kinds of aquaporins have been found in Gossypium hirsutum, they are plasma membrane intrinsic protein and tonoplast intrinsic protein.
8、And former one only be found have expressed in the root, stalk and ovule but very rare in leaf. In this research，adopting the method of RT-PCR and according to the aquaporin genes primer of Gossypium hirsutum published on the GenBank, we got four Gossypium hirsutum plasma membrane aquaporin genes by
9、 cloning. They are follows: GhPIP1;1, GhPIP1;2, GhPIP2;1 and GhPIP2;2, and the testing sequence results show that the similarity between the sequences of these four genes and the published four is over 98%; what is more, the similarity between the sequences of amino acid is over 99%.Then expression
10、vector pBI121-GhPIP has been constructured.，and transferred into model plant tobacco mediated by agrobacterium. We have got transgenic tobacco. After preliminary RT-PCR analysis, we know that the transcription of transgenic plant is normal. In the study, 300bp of four genes had been selected separat
11、ely as the interference fragments to construct interference vector of RNA. Firstly, intermediate vector was constructed, then it was constructed on the expression vector pCAM2300 to transform the callus of embryo. After observing the growth condition of transformed callus, measuring the total weight
12、 of callus and the weight of callus without free water, the results of control group showed that callus ability of controlling water had been improved. And this also showed that interference purpose had been achieved and the gene had been kept silence. The study has set foundation for the further st
13、udy on similar gene. Key words: Aquaporins, Plasma membrane intrinsic protein, RNAi VI 前 言 水孔蛋白(aquaporin， AQP)是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子的水通 道蛋白1，它大量存在于动物、植物及微生物等多种生物中。它所介导的自由水 快速被动地跨生物膜转运是水进出细胞的主要途径。 植物水孔蛋白根据蛋白质氨基酸序列的同源性及结构特征可分为四大类： (1) 质膜内在蛋白PIPs(Plasma membrane intrinsic proteins)位于质膜上，分为PIP1、2、 3 三类；(2)
14、液泡膜内在蛋白TIPs(Tonoplast intrinsic proteins)处于液泡膜上，分为 A、B、C、DTIP四类，大部分PIP和TIP都属于水选择性通道蛋白；(3)NLM蛋白 NIPs(Nodulin 26-like intrinsic proteins)；(4)小的基本膜内蛋白SIPs(small and basic intrinsic proteins)。 很多的研究表明， 植物中往往存在多个水孔蛋白同源物且含量 丰富，有时甚至是细胞膜的一个主要成分。 在植物发育过程中编码不同水孔蛋白的基因的表达与不同的生理过程相 关，包括气孔的关闭、器官运动、细胞伸长以及细胞分裂，而且它还
15、在植物种子 萌发、韧皮部的装卸及逆境应答等过程中调节水分跨膜快速流动，因此植物水孔 蛋白在植物体内形成水选择性运输通道，介导胞内或胞间的水分跨膜运输，调节 植物体内的水分快速平衡，对于提高植物抗盐及抗旱性可能发挥着重要作用。所 以本研究的主要研究对象新疆陆地棉系列， 试图通过对棉花水孔蛋白基因的功能 研究从而从某种程度上能提高棉花的抗旱性。 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA(double-stranded RNA， dsRNA)诱发的、 同源 mRNA 高效特异性降解的现象。 近几年来 RNAi 研究取得了突破性进展，被Sc
16、ience杂志评为 2001 年的十大 科学进展之一，并名列 2002 年十大科学进展之首。简单的说是指一种分子生物 学上由双链 RNA 诱发的基因沉默现象。 当细胞中导入与内源性 mRNA 编码区同 源的双链 RNA 时，该 mRNA 发生降解而导致基因表达沉默。RNAi 因其具有特 异的靶向性成为分析基因功能的有力工具。RNAi 技术应用于植物抗逆性方面的 研究尚处于起始阶段。 本研究主要是试图把棉花水孔蛋白基因构建到植物表达载体pBI121上，转 化模式植物烟草，先期研究该基因的一些功能，因为国内外几乎没有或者很少有 棉花叶片水孔蛋白基因功能的相关研究报导。然后通过构建RNA干扰载体，利 用RNA干扰技术研究棉花叶片水孔蛋白基因的功能，通过RNA干扰降低棉花叶 片水孔蛋白的表达量来减少水分在棉花叶片的丧失， 从而达到提高棉花抗旱性的 目的。 V 英文缩写表 英文缩写 英文全称 中文名称 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 2,4-D 2,4-dichlorophexoxyacetic acid 2,4 二氯苯氧乙酸 6-BA 6-Benzylaminopu
