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1、河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完 成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大 学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。 凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医 科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北 医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。 研究生签名：在撕导师签章彰二级学院每| 扫p 年6 月。产日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果， 除了文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已经发表或 撰
2、写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立 撰写，文责自负。 研究生签名：仁栅 导师氍啼名锄 知f 。年6 月名日 目录 中文摘要1 英文摘要5 研究论文辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠凝血功能及肝脏C 反应蛋白 的影响 前言一10 朗舂”lU 材料与方法“11 结果l7 附图2 0 附表2 5 讨论2 8 参考文献3 4 综述脓毒症引起凝血功能紊乱的监测及治疗进展3 7 致谢4 6 个人简历4 7 中文摘要 辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠 凝血功能及肝脏C 反应蛋白的影响 摘要 目的：脓毒症( s e p s i s ) 是感染病原体与宿主免疫系统、炎症反应、凝血 反应之间相互作用，造成机
3、体器官功能损害的复杂临床综合征，是危重患 者的最主要死亡原因之一。在脓毒症时，同时启动的炎症反应与凝血级联 反应构成其主要病理生理机制，过度的炎症反应和失控的凝血瀑布效应最 终可导致器官功能障碍甚至死亡。脓毒症患者中凝血系统功能紊乱非常普 遍，包括促凝活性增强、抗凝活性减弱、纤溶系统受抑制等，凝血系统过 度激活最终引起凝血因子消耗和出血倾向，而发生弥散性血管内凝血 ( d i s s e m i n a t e di n t r a v a s c u l a rc o a g u l a t i o n ，D I C ) 。毛细血管内微血栓的形成是 脓毒症的重要特征之一。近年来国外研究发现他
4、汀类药物作为脓毒症治疗 药物能够有效保护血管内皮细胞功能，具有抗炎、抗凝、减轻重要脏器损 伤等作用，并降低死亡率，为脓毒症的治疗提供了新的手段。本研究应用 盲肠结扎穿孔术( c e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r e ，C L P ) 建立脓毒症大鼠模型， 观察辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠凝血功能及肝脏C 反应蛋白( C r e a c t i v e p r o t e i n ，C R P ) 的影响，通过多个观察时间点认识脓毒症病生理的发生与发 展及他汀类药物的保护作用机制，以期用新的干预方式治疗脓毒症，减少 并发症，降低病死率。 方法：清洁级
5、健康雌性w i s t a r 大鼠8 0 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ( 河北医科 大学实验动物中心提供) 。随机分为4 组：正常对照组( I 组，n = 8 ) ：麻 醉后活杀动物；假手术组( I I 组，n = 2 4 ) ：麻醉后开腹翻动盲肠后关腹； 脓毒症模型组( I I I 组，n = 2 4 ) ：麻醉后开腹行盲肠结扎穿孔术：辛伐他汀 预处理组( I V 组，n = 2 4 ) ：盲肠结扎穿孔术前给予辛伐他汀2 0 r a g k g “ 1 d a y ， 溶于l m l 灭菌注射用水，灌胃连续两周，其余各组给予等量的生理盐水灌 胃。各实验组按时间点( 6 h 、2 4
6、 h 、4 8 h ) 处死大鼠留取标本，每个时间点 活杀8 只大鼠，留取血液及肝组织标本。 监测并记录各组大鼠一般表现如：被毛、精神状态、肛温及存活率； 应用全自动血液分析仪对各组大鼠全血白细胞及血小板计数进行测定；留 L 中文摘要 取的血清标本进行组织因子( t i s s u ef a c t o r ，T F ) 、纤溶酶原激活物抑制物 ( p l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r - 1 ，P A I 1 ) 检测；留取肝组织标本应用免疫 组化法检测C I 冲水平。 全部数据采用S P S S12 0 统计软件进行
7、统计学分析，计量资料数据以 均数4 - 标准差( 工s ) 表示，组间比较采用单因素方差分析( O n ew a y A N O V A ) ，计数资料采用x2 检验( 确切概率法) ，P 0 0 5 ) 。 3 白细胞计数 脓毒症模型组大鼠6 h 、2 4 h 、4 8 h 白细胞计数较假手术组比较均值下 降5 0 ，脓毒症模型符合动物S I R S 诊断标准。 4 肛温比较 电子体温计监测各组大鼠直肠温度。脓毒症模型组大鼠6 h 、2 4 h 、4 8 h 肛温较假手术组比较下降超过l ，脓毒症模型符合动物S I R S 诊断标准。 5 组织因子( T F ) 中文摘要 假手术各时间点T
8、F 含量与正常对照组比较差异无统计学意义( P 均 0 5 ) ；C L P 后6 h 、2 4 h 、4 8 h 血清T F 含量均明显高于假手术组( P 0 0 5 ) T h el e v e lo fT Fi nC L P g r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t h t h a ti ns h a mg r o u pa t 6 h ，2 4 h ，4 8 hp o i n ta f t e rC L P ( P O 5 ) ；C L P 后6 h 、2 4 h 、4 8
9、h 血清T F 含量均明显高于假手术组( P 0 0 5 ；C o m p a r e dt og r o u p l I I P 0 0 5 ；C o m p a r e dt og r o u p l I I P 0 0 5 T a b l e 6C h a n g e so f P L Ti ne a c hg r o u p ( 二4 - s ，1 0 9 L ) G r o u p n6 h2 4 h 4 8 h I87 5 0 0 0 _ _ _ 2 6 3 8 _ I I I I I 2 4 7 0 2 3 34 - 6 5 7 7 6 8 6 3 34 - 4 4 11 2 4
10、 5 2 4 0 0 6 5 7 451 4 3 34 - 3 2 3 2 2 46 2 9 3 3 4 - 3 1 9 4 5 7 1 6 7 4 - 2 2 0 1 7 2 0 0 0 _ _ _ 4 0 0 0 章 4 5 2 O O 3 2 O O 5 4 6 0 04 - 3 4 0 4 C o m p a r e dt og r o u pI I 。P 0 0 5 ；C o m p a r e dt og r o u p l I I P 0 0 5 ；C o m p a r e dt og r o u p I V 0 0 5 ；C o m p a r e dt og r o u p
11、 I I l P 0 0 5 ；C o m p a r e dt og r o u p I V O 0 5 研究论文 讨论 l 脓毒症动物模型制备方法的选择 脓毒症动物模型常用制作方法：内毒素( L P S ) 诱导、细菌注射、腹 膜炎模型即盲肠结扎穿孔模型。L P S 诱导模型具有方法简单快捷、模型稳 定、易于评定等优点。动物的血流动力学改变与内毒素的剂量直接相关， 该动物模型的建立可用于对感染性休克发病机制的探讨，筛选评价治疗措 施M 1 。 细菌注射造模的优点是操作方便、可重复性好，一次性大量注入后可 在短时间内出现血压下降等休克症状，但与临床脓毒症的发病过程及血流 动力学特点有着明显的
12、差别。一次性大剂量活菌注入血循环对机体的影响 是中毒而不是感染，菌株入血后很快就被血清灭活，失去在动物体内繁殖 的能力。并且很快造成心血管系统功能紊乱，因此不出现脓毒症患者特有 的早期高排低阻型血流动力学特点，而是一开始即呈现低排高阻型血流动 力学改变。此模型病情发展快，存活时间短，许多方面与临床脓毒症发展 过程很不一致 5 1 。 C L P 模型是目前最常用的脓毒症动物模型，可模拟人类阑尾炎病例而 造成混合型细菌感染，操作简单、可重复性强，与人类疾病发展过程近似， 是一个渐进性、相对缓慢的过程，刺激因素持久存在，生理功能的失代偿、 组织的损害及功能紊乱逐渐发展。可模拟出入类疾病的早期高排低
13、阻、晚 期低排高阻的血流动力学过程，动物体内的细胞因子反应也类似临床脓毒 症患者，增强了C L P 模型的临床可靠性。但该模型也存在一定缺陷，如： 一定比例模型的腹腔感染灶被网膜及周围组织包裹而局限，且逐渐恢复， 不会发展为脓毒症，另一方面，模型的严重程度受多种因素影响，如：动 物种属、穿孔大小、流入腹腔粪便量多少、盲肠结扎范围及程度等因素不 易控制和统- - 6 1 。本实验在预实验阶段能够熟练掌握造模方法，为正式实 验时制造严重程度相对一致的脓毒症模型奠定了基础。 根据M O D S 动物模型的复制实践及临床S I R S 的诊断依据，胡森提出动 物S I R S f l 勺诊断标准【7
14、】：直肠温度较正常或伤前升高或降低1 ；呼吸 频率超过对照值2 倍或P a C 0 2 较对照值降低2 5 ；白细胞总数超过对照值 的2 倍或减少5 0 ；心率较对照值增加5 0 。值得注意的是，受动物麻 研究论文 醉或紧张等因素的影响，常难于测得准确的呼吸和心率。因此，上述几项 参数中，采用直肠温度、P a C 0 2 、白细胞计数和分类的变化进行诊断相对 较为准确。 本实验造模后大鼠精神萎靡，身体蜷缩，竖毛，呼吸频率加快，直肠 温度降低，少量活动、饮水，对刺激反应迟钝，腹胀明显，排泄稀水样便。 剖腹后可闻及恶臭，结扎端盲肠发黑，表面有黄色脓液，小肠肠管胀气， 腹腔内大量血性渗出液，肝脏表面
15、出现大量瘀点，与C h a u d r y 等【2 】和 H u b b a r d 等【3 】报道的脓毒症模型标准符合。同时我们对各组大鼠的直肠温 度及血常规进行检测，脓毒症模型的大鼠6 h 、2 4 h 、4 8 h 较假手术组比较直 肠温度降低均超过l ，造模组白细胞计数较假手术组下降，白细胞总数 与对照组比较减少超过5 0 ，符合动物S I R S f l 勺诊断标准，并且在手术过程 中及剖腹后有明显感染证据，根据以上主、客观监测指标可视为脓毒症造 模成功。 2 组织因子在脓毒症凝血功能紊乱中的作用 T F 又称凝血因子I I I 或组织凝血活酶，是凝血过程的启动因子。它定 位于C D l 4 2 ，是一种相对分子质量约为4 7 0 0 0 的跨膜糖蛋白，由2 6 3 个氨
