《载铜硅酸盐纳米微粒对断奶仔猪肠道病原菌吸附、杀菌机理的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《载铜硅酸盐纳米微粒对断奶仔猪肠道病原菌吸附、杀菌机理的研究（164页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学动物科学学院 博士学位论文 载铜硅酸盐纳米微粒对断奶仔猪肠道病原菌吸附、杀菌机理的 研究 姓名：郭彤 申请学位级别：博士 专业：动物营养与饲料科学 指导教师：许梓荣 20040501 致谢 本论文是在导师许梓荣教授的悉心指导下完成的。从论文选题、设计、试验 实施到论文写作的每一个环节，无不凝聚导师大量的心血，使得本论文顺利完成。 导师严谨的治学态度、渊博的知识、前瞻性的思维风格、正直无私的博大胸怀、 果断的工作作风和求实的科学精神，时时影响着我，激励着我，并将成为我终身 受益的宝贵财富。在攻读博士学位期间，导师对我的学习和生活给予了无微不至 的关怀。在此，诚挚的向尊敬的导师许梓荣教授致
2、以崇高的敬意和衷心的感谢! 本论文主要工作是在浙江大学饲料科学研究所完成的，感谢饲料所提供了一 流的科研条件和充足的科研经费。本论文完成过程中，得到了许多老师和同学的 大力支持和帮助。感谢汪以真教授、孙建义教授、邹晓庭教授、夏枚生副研究员、 胡彩虹、王敏奇、李卫芬、刘波静、冯杰等全体老师给予的指导和关心；感谢杨 晓刚、李奎、熊莉、单体中、张锐、李民、许英蕾、江霞、张利环、杨荣芳、张 波等同学在试验过程中给予的帮助；感谢周一学习室的马玉龙、张文举、吕文乎 博士、韩新燕、魏克强、陶新提供学习上的无私帮助；感谢贾仁清、施俊轶、韩 作农老师对我的关爱与帮助。感谢所有师弟、师妹在三年中给予的帮助和关，已
3、、! 本论文细胞培养部分的工作是在动物科学学院完成的，得到许多老师给予的 有价值的建议和帮助。特别要感谢刘建新教授、方维焕教授在论文自设计和试验 中提出的宝贵意见和无私帮助：感谢方维焕教授、张才乔教援及实验室的老师和 同学为本论文顺利完成提供的良好的细胞培养条件以及在实验过程中给予的热心 指导和帮助。在此，向他们表示衷心的感谢! 宁波梅湖种猪厂为我提供了良好的饲养试验场地，在此对该厂全体领导和员 工的大力支持与协助深表感谢。 感谢父母、丈夫及家人在三年来对我学业的全力支持和鼓励，使我不断克服 困难，取得迸步，顺利完成学业。 谨向参加本论文评阅和答辩的专家致以诚挚的谢意! 值此论文完成之际，谨以
4、本文献给所有关心、帮助和爱护我的领导、老师、 同学和朋友们，祝他们一切顺利! 郭彤 2 0 0 45 于杭州华家池 A F M A L P A I _ T A S T B A T H C a c o 2 C E C D M E M D M S O D N A E D T A F B S H B S S L D H M B C M H M I C M T T M R S L S N C S N P B S P P M r p m S E M X R D 主要缩写词 A t o m i cF o r c eM i c r o s c o p e原子力显微镜 A l k a l i n ep h o
5、 s p h a t a s e碱性磷酸酶 A l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e丙氨酸氨基转移酶 A s p a r t a t et r a n s a m i n a s e 天冬氨酸氨基转移酶 B a c t e r i aa d h e s i o nt Oh e x a d e c a n e细菌粘附到碳水化合物试验法 H u m a nc o l o nc a r c i n o m ac e l ll i n e人结肠腺癌细胞 C a t i o ne x c h a n g e c a p a c i t y 离子交换容量 D
6、 u l b e c c oM o d i f i e d E a g l e SM e d i u m D M E M 培养基 D i m e t h y ls n l f o x i d e 二甲基亚砜 D e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 F e t a lb o v i n es e n l m胎牛血清 H a n k Sb u f f e r e ds a l ts o l u t i o n H a n
7、 k S 平衡盐溶液 L a c t a t ed e h y d r o g e n a s e乳酸脱氢酶 M i n i m u nb a c t e r i c i d a lC O n c e n t r a t i o n最小杀菌浓度 M u l l e r H i n t o n M H 培养基 M i n i m u m i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n最小抑菌浓度 D i m e t h y l t h i a z o l d i p h e n y i t e t r a z o l i u m 二甲基噻唑二苯基四 b
8、r o m i d e 唑溴盐 D eM a n R o g o s aS h a r p eM R S 培养基 L a y e rS i l i c a t en a n o p a r t i c l e s层状硅酸盐纳米微粒 C o p p e rS i l i c a t en a n o p a r t i e l e s载铜硅酸盐纳米微粒 P h o s p h a t e b u f f e r e ds N i n e磷酸赫缓冲液 P o t e n t i a l l yP a t h o g e n i cM i c r o o r g a n i s m 潜在致病微生物
9、R e v o l m i o n s p e r m i n u t e 转数分 S c a nE l e c t r o n i cM i c r o s c o p e 扫描电子显微镜 X r a yd i f f r a c t i o nX 射线衍射 中文摘要 抗生素和高铜被广泛用作动物促蛳D n J t f 。但长期使用此类添加剂存在细 菌耐药性、抗生素残留和环境污染等种种弊端。因此，本课题旨在以层状硅酸盐 ( L S N ) 为载体，通过阳离子交换反应，并结合纳米技术，构建出载铜硅酸盐纳米微 粒( C S N ) 。将L S N 和C S N 作为试验材料，以断奶仔猪肠道细菌作为
10、测试对象，采 用C a c o 一2 细胞培养试验、体外吸附和杀菌试验以及饲养试验等方法，分析和研究 了其作为一种替代抗生素饲料添加剂的可行性和可能性。 采用C a c o 一2 细胞模型，体外首先研究了仔猪肠道四种细菌大肠杆菌K 8 8 ( Ec o l i 如P ) 、猪霍乱沙门氏菌( Sc h o l e r a e s u i s ) ，嗜酸乳杆菌( 三，a c i d o p h i l u s ) 和两歧双 歧杆菌( 口b i f i d u m ) 粘附细胞的基本特点及影响因素；进而研究了加入不同浓度 的L S N 和C S N 对C a c o 2 细胞的影响、对这四种细菌粘附
11、和入侵肠上皮细胞的影 响以及对肠粘膜形态的影响。 体外还将L S N 及C S N 对四种细菌的吸附和杀菌能力迸行了研究。吸附试验中， 首先对材料进行了表征，进而研究了在不同时间、不同粒径、不同p H 、不同离子 强度、不同温度和不同矿物细菌质量比的条件下，对四种细菌吸附性能的影响并 进行机理探讨。 杀菌试验中，采用最小抑菌浓度法( M I C ) 、“h a l o ”试验法及改良的振荡瓶法 在不同时间、不同浓度、不同粒径及不同温度下的C S N 对四种细菌的体外杀菌效 果做了定性和定量研究，并通过对细菌细胞壁、K _ 外流、细菌胞内酶、细菌呼吸 代谢、有无光照以及铜离子释放量的影响探讨其杀
12、菌机理。 饲养试验中，以2 8 - - + 2 日龄断奶“杜长大”三元杂交仔猪为试验对象，研究 了添加O 2 和O 3 C S N 、2 5 0 m g & g 硫酸锕及l O O m g k g 金霉素对断奶仔猪生长性 能、腹泻率、肠道微生物菌群、十二指肠及胰脏消化酶、空肠粘膜二糖酶活性以 及小肠粘膜形态结构几方面的影响，并对其作用机理初步进行探讨。选择1 6 0 头 健康“杜长大”三元杂交仔猪( 初重7 5 O 3 k g ) 按试验要求分为5 组( 含一个基 础日粮组) ，每组4 个重复，每个重复8 头( 公母各半) 。预饲期7 天，正式期4 5 天。饲养试验结束后，每组各选体重相近的猪
13、8 头( 公母各半) ，共4 0 头，按常 规方法屠宰，取相关内容物、血清和组织样品进行肠道微生物菌群、消化酶和粘 膜二糖酶活性、小肠粘膜形态结构以及铜、铁、锌含量的测定。主要研究结果如 下： 1 细胞培养试验表明，病原菌Ec o l iK s 8 、Sc h o l e r a e s u i s 对细胞的粘附能力 分别为1 2 2 ，1 1 7 ；有益菌上a c i d o p h i l u s 和Bb i f i d u m 对细胞的粘附能力分别 为1 5 6 和1 7 7 ，可见病原菌对细胞的粘附能力明显低于有益菌( P 0 0 5 ) 。分析其原因可能 是由于细胞对营养物质的需要有
14、一个限度，超过这个限度，即使营养水平再高， 细胞也不能利用；而且浓度过高，影响到培养液的渗透压，进而影响细胞的生存。 2 3 2 细菌粘附对C a c o - 2 细胞存活率的影响 如如0 浙江土学博士学位论文摹五幸 仔猎肠道田种细酋粘附伽P 细胞的竹竞 结果表明，Ec o l iK s 8 和& c h o l e r a e s u i s 粘附C a c o 一2 细胞后，随粘附时间的延 长，细胞存活率逐渐降低，分别从l h 的9 4 2 ，9 3 8 降低到6 h 的8 1 4 ，7 82 ； 与对照组相比，1 h 差异显著( P ( O ，0 5 ) ，而培养3 h 后差异极显著(
15、P O 0 5 ) 。试验数据见表5 2 。研究表明，Ec o l i K s s 和sc h o l e r a e s u i s 粘附C a c o 一2 细胞后降低了活细胞的数量，说明它们对细胞具有毒害作用。而L a c i d o p h i l u s 和 Bb i f i d u m 对细胞无毒害作用。粘附能力通常被认为是病原菌的一种重要的毒力因 子( F i n l a y 等，1 9 9 7 ) ，粘附于肠道粘膜，是病原菌定植并产生临床症状的前提条 件。也证实了Ec o l i K s 日和Sc h o l e r a e s u i s 具有致病作用。 表5 2 四种细菌粘
16、附C a c o 2 细胞对其存活率的影响( ) T a h t e5 2 E f f e c t s o f a d h e s i o n o f f o u rb a c t e r i a o n C a c o 一2c e l l s l i v a b i l 时( ) 时间( h )试验组 堑墼堡太监拄聋K s s毽重重L 鎏【 医萱堕酶至L 圭壬萱煎蝰塑堕枉董 19 81 049 42 2 3 +9 2 6 2 I +9 82 05 9 83 08 39 86 0 38 96 2 1 + + 8 73 I6 + +9 8 7 O8 9 86 05 69 9 2 078 14 15 “7 8 2 士2 2 + +9 95 04 9 95 - + 06 注与对照纽相比，差异显著：P S i - O H 2 + S i O H ”+ H + S i O H ” S i 。O + H + 其中 S i 代表与
