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1、中南大学 博士学位论文 载脂蛋白A5调节甘油三酯代谢机制及其临床意义 姓名：黄贤圣 申请学位级别：博士 专业：内科学 指导教师：赵水平 20090501 中南大学博士学位论文 中文摘要 中文摘要 背景： 血浆甘油三酯( T G ) 升高是冠心病的独立危险因素，引起高甘 油三酯血症( H T G ) 常见原因包括高果糖饮食、急性期反应( A P R ) 、 代谢综合征( M S ) 等。降低T G 可有效防止冠心病，目前可降低T G 的降脂药物主要有：他汀类、贝特类和血脂康等。 载脂蛋白A 5 ( A p o A 5 ) 是新发现的载脂蛋白超家族成员，大量 研究均证实，A p o A 5 可显著
2、降低血浆T G 。过氧化物酶体增殖物激活 受体a ( P P A R a ) 和肝X 受体Q ( L X R a ) 是调节A p o A 5 表达的两个 关键核受体，其中，前者上调A p o A 5 表达，而后者下调A p o A 5 表达。 然而，目前尚不清楚高果糖饮食、急性期反应以及代谢综合征诱 导的H T G 是否与A p o A 5 有关；也不知他汀类、贝特类或血脂康降 低T G 是否通过A p o A 5 而起作用。 目的： 明确高果糖饮食、急性期反应以及代谢综合征诱导的H T G 是否 与A p o A 5 有关，明确非诺贝特、阿托伐他汀和血脂康降T G 作用是 否与调节A p
3、o A 5 有关，并探讨核受体P P A R a 和L X R a 对A p o A 5 表 达的调节作用。 方法： 一果糖诱导性高甘油三血症的动物和体外实验 4 0 只健康雄性S p r a g u e D a w l e y 大鼠，随机分为五组( n = 8 组) ： ( 1 ) 对照组：正常普通饮食喂养；( 2 ) H T G 组：1 0 果糖水喂养2 周建立高H T G 大鼠模型，并继续喂养4 周；( 3 ) 贝特组：H T G 大鼠 建模后，加予非诺贝特( 1 0 0m g k g 天) 干预4 周；( 4 ) 他汀组：H T G 大鼠建模后，加予阿托伐他汀( 1 0m g k g
4、天) 干预4 周；( 5 ) 联合组： 中南大学博士学位论文 中文摘要 H T G 大鼠建模后，加予非诺贝特( 1 0 0m g k g 天) 和阿托伐他汀( 1 0 m g k g 天) 干预4 周。分别在0 周、2 周及6 周测定体重和空腹血脂。 6 周后取动物肝脏组织标本，采用免疫组化、逆转录多聚酶链式反应 ( R T - P C R ) 及免疫印迹( W B ) 测定肝脏A p o A 5 的基因和蛋白表达， 同时采用R T - P C R 和W B 测定肝脏P P A R a 和L X R Q t 的基因和蛋白表 达。 以H e p G 2 细胞为模型，观察果糖、非诺贝特和阿托伐他汀
5、干预 后，细胞T G 浓度变化，A p o A 5 、P P A R o t 和L X R Q t 表达的改变，并通 过P P A R a 或L X R a 的激动剂或抑制剂干预，揭示三者调控A p o A 5 表 达的机制。 二急性期反应性高甘油三酯血症的l 隘床、动物及体外实验 ( - - ) A C S 临床试验 入选2 2 8 例A C S 患者和2 3 2 名健康者作为研究对象，抽血分离血 浆，采用酶联免疫吸附检测( E L I S A ) 测定A p o A 5 血浆浓度，同时 测定血浆C 反应蛋白和血脂水平。 ( - - ) 急性炎症动物和体外实验 3 2 只6 周龄健康雌性C
6、5 7 B L 6 鼠，随机分为4 组( n = 8 组) ：( 1 ) 对照组，普通饮食喂养；( 2 ) 炎症组，普通饮食喂养4 周后，腹腔注 射1 0 0 p g 脂多糖( L P S ) 以建立急性炎症模型；( 3 ) 他汀组：阿托伐 他汀( 1 0m g k g 天) 干预4 周后，腹腔注射L P S ；( 4 ) 贝特组，非诺 贝特( 1 0 0m g k g 天) 干预4 周后，腹腔注射L P S 。分别在实验第0 周、第4 周注射L P S 前、以及注射L P S 后测定空腹血脂和肿瘤坏死 因子0 【( n 师O 【) 血浆水平。注射L P S 后取动物肝脏组织标本，采用 R T
7、 - P C R 和W B 测定肝脏A p o A 5 和P P A R a 的基因和蛋白表达。 体外观察人重组T N F O L 对H e p G 2 细胞T G 及A p o A 5 和P P A R a 表 中南人学博士学位论文中文摘要 达的影响，同时观察阿托伐他汀和非诺贝特对T N F a 刺激下肝细胞 A p o A 5 表达的影响及其机制。 三血脂康降低冠心病患者甘油三酯的机制研究 ( 一) 血脂康降脂临床试验 入选6 0 例稳定性冠心病患者，随机分为两组，即血脂康组和对 照组，分别接受血脂康( 6 0 0m g 次，一天两次) 和安慰剂治疗，疗 程共6 周。实验前和实验第6 周，
8、采用E L I S A 测定血浆A p o A 5 浓度， 同时测定空腹血脂水平。 ( 二) 动物和细胞实验 3 2 只健康雄性S p r a g u e - D a w l e y 大鼠，随机分为四组( n = 8 组) ： ( 1 ) 对照组：正常普通饮食喂养；( 2 ) 高甘油三酯血脂( H T G ) 组： 1 0 果糖水喂养2 周建立H T G 大鼠模型，并继续喂养4 周；( 3 ) 血 脂康低剂量( L X Z K ) 组，1 0 果糖水喂养2 周建立H T G 大鼠模型 后，加予血脂康2 0m g k g 天进行药物干预，干预4 周；( 4 ) 血脂康 高剂量( H X Z K
9、) 组，建立H T G 大鼠模型后，加予血脂康4 0m g k g 天进行药物干预，干预4 周。分别在实验前( O 周) 、实验后2 周及6 周测定空腹血脂水平。分别采用R T - P C R 和W B 测定肝脏A p o A 5 、 P P A R a 和L X R a 的基因和蛋白表达。 体外观察血脂康干预对H e p G 2 细胞T G 、以及A p o A 5 、P P A R a 和L X R a 表达的影响及其机制。 四代谢综合征I 临床、动物及体外实验 ( 一) 代谢综合征临床试验 入选3 4 0 例代谢综合征( M S ) 患者和3 4 2 名健康者作为研究对象， 采用E L
10、I S A 测定A p o A 5 血浆浓度，同时测定空腹血脂、血糖和胰岛 素，计算胰岛素抵抗指数( H O M A I R ) 。 I I I 中南大学博士学位论文中文摘要 ( 二) 动物和细胞实验 2 4 只8 周龄的健康雄性S p r a g u e D a w l e y 大鼠，随机分为3 组 ( n = 8 组) ：( 1 ) 对照组：普通饮食；( 2 ) M S 组：高果糖饮食( 含 6 0 果糖) ，喂养7 周；( 3 ) 贝特组：高果糖饮食加予非诺贝特1 0 0 m g k g 天，干预7 周。分另I J 在实验第0 周和第7 周测定空腹血脂和尾 动脉血压，并通过高胰岛素正常血
11、糖钳夹技术测定胰岛素敏感性。实 验结束时，取动物肝脏组织标本，采用R T - P C R 和W B 测定肝脏A p o A 5 的基因和蛋白表达。 通过高浓度胰岛素诱导H e p G 2 细胞，构建胰岛素抵抗( I R ) 肝 细胞模型，体外观察胰岛素抵抗状况下肝细胞的A p o A 5 表达和T G 变化，探讨非诺贝特对I R 状况下肝细胞A p o A 5 表达的影响及其机制。 结果： 一果糖诱导性高甘油三酯血症动物和体外实验结果 1 6 周后，H T G 组大鼠血浆T G 显著升高，而药物治疗组T G 均显 著降低，降低程度依次为：他汀组 8 5c m ； ( 2 ) T G 1 7m
12、m o l L ： ( 3 ) H D L C 1 6 1m m o l L 、餐后2 小时血糖 1 7 8m m o l L 或有2 型糖尿 病史。 ( 三) 排除标准 有以下情况之一者排除在本研究之外：( 1 ) 1 型糖尿病；( 2 ) 合并急慢性感 染、自身免疫性疾病、脑卒中、恶性肿瘤或肝肾功能明显异常者；( 3 ) 合并外科 手术或严重创伤者；( 4 ) 合并甲状腺功能异常者；( 5 ) 之前接受过降脂药物、抗 炎药和免疫抑制剂治疗者；( 6 ) 严重心功能衰竭者；( 7 ) 妊娠者。 ( 四) 一般资料的收集 收集所有入选者的一般资料包括年龄、性别、身高、体重、血压、主诉、既 往史
13、、吸烟饮酒史、用药史等。 ( 五) 标本的采集和处理 所有患者均于入院次日清晨采集空腹外周血4 m l ，置抗凝管中以3 0 0 0r p m 离心5 分钟分离血浆，取上清液置1 5 m lE P 管中一2 0 低温保存待检，用以测定 l O l 中南大学博士学位论文第四章 血浆A p o A 5 浓度。 另外同时取空腹外周血查空腹血脂、血糖、胰岛素、肝肾功能等，均采用盲 法测定，由检验科专人质控检验。 ( 六) 血浆A p o A 5 浓度检测 血浆A p o A 5 浓度检测采用我研究所自主研发的人A p o A 5 酶联免疫吸附检测 法( E L I S A ) 试剂盒，该试剂盒检测灵敏
14、度可达O 3n g m l ，组内及组间变异系数 良好( 5 7 1 “ - - - 7 5 2 ) 。具体操作步骤如下： 1 加参考品、控制液和待检标本各两孔，1 0 0 u U 孔。 2 3 7 温育6 0 分钟。 3 甩去孔中的液体，用洗涤液洗涤5 次，每次洗涤后必须将孔中液体在吸水 纸上拍干。 4 将酶标抗体用酶标抗体稀释液1 ：2 0 0 稀释，用移液器加入各反应孔，1 0 0 u U 孔。 5 3 7 避光温育6 0 分钟。 6 甩去孔中的液体，用洗涤液洗涤5 次，每次洗涤后必须将孔中液体在吸水 纸上拍干。 7 用移液器加入显色液，l O O u 蚜L ，3 7 避光放置1 5 分
15、钟。 8 用移液器加入终止液，1 0 0 u l 孔，混匀后在全自动酶标仪上于4 5 0 n m 6 3 0 n m 双波长下读数。 9 绘制标准曲线：根据标准孔的吸光度绘制标准曲线，以吸光度为纵坐标， A p o A 5 浓度为横坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。 ( 七) 胰岛素抵抗指数计算 本研究采用胰岛素抵抗指数( h o m e o s t a s i sm o d e la s s e s s m e n to fi n s u l i n r e s i s t a n c e ，H O M A I R ) 评价研究对象的胰岛素抵抗程度，其计算方法为：【空腹 血糖浓度值( r
16、e t o o l L ) 空腹胰岛素浓度值( m I U L ) 】2 2 5 。 ( 八) 统计方法 统计分析采用S P S S1 5 0 软件分析。凡不符合正态分布的变量，均先经对数 转换后再进行统计分析。计量资料采用均数4 - 标准差表示，多组数据采用单因素 方差分析，组间两两比较用S N K 检验，两组比较用t 检验；计数资料采用卡方 检验。数据相关性分析采用P e a r s o n 相似性检验。均以P Ca n dc 5 6 C Gp o l y m o r p h i s m so n l i p i d s ，d y s l i p i d e m i aa n dm e t a b o l i cs y n d r o m ei nT u r k i s ha d u l t s C l i nC h e mL a b M e d 2 0 0 8 ；4 6 ：7 7 8 8 4 【2 3 K
