紫外分光光度法的原理教程

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1、第七章 紫外分光光度法的原理和应用 一. 比色分析的原理：光是一种电磁波，它 的波长用nm或为单位，人的眼睛所能感觉到 的光波长约400760 nm，这之间的光波称为可 见光。短于400 nm的叫紫外线，短于200nm的 叫远紫外线，再短的就是X射线和射线了。长 于760nm的叫红外线，红外线可长达5mm，再 长的就是无线电波了。 普通的日光、白炽灯光称为发射光，将这种 日光或白炽光通过棱镜可以分解为红、橙、黄 、 绿、蓝、青、紫等组成的光谱，称为发射光谱 。如果在白炽灯光与棱镜之间放一个有色溶液 的玻璃皿，则通过棱镜后的光谱上会出现一处 或几处暗带，这种带有暗带的光谱称为该有色 溶液的吸收光

2、谱，吸收光谱显示该溶液对光的 选择性吸收的特性。溶液所呈现的颜色是它的 吸收光谱中透过最多、吸收最少的那部分波长 光线的颜色，而暗带部分则是它透过最少、吸 收最多的那部分波长光线的颜色。 不同分子的原子团和原子，它的发射光谱和 吸收光谱不同。因此可以根据其光谱的特征和 强度研究化合物的结构和测定其含量，称为光 谱分析法，这也是比色分析的原理。根据发射 光谱分析的如火焰发射光谱法（又称火焰光度 法，分析钠、钾、钙），荧光光度和荧光分光 光度法（根据荧光的发射强度进行分析）。 根据吸收光谱分析的方法又称吸光光度法， 如应用可见光的吸收光谱进行分析的普通的分 光光度计和分光光度法；用紫外光的吸收光谱

3、 进行分析的叫紫外分光光度计和紫外分光光度 法；用原子的吸收光谱进行分析的方法叫原子 吸收分光光度计和原子吸收分光光度法。 硒-邻苯二胺络合物的吸收光谱特征吸收峰332.5nm 氧化钬的吸收光谱 二. 郎伯-比尔定律：当一束单色入射光 I0通过 厚度为L、浓度为C的有色溶液后，所透过光的 强度 I1 与溶液厚度L及浓度C成负指数乘积的 关系：I1=I010KLC 如果物质在溶液中的浓度 和显色强度成正比，则可以应用郎伯-比尔定律 通过比色方法从显色强度求浓度，这是比色分 析的原理。 入射光强度I0 透过光强度I1 溶液厚度L（比色杯直径 ） I1=I010KLC移项成：I1/I0=10KLC

4、式中K为常 数，可因物质的吸光特性和采用单色光的波长 不同而有所不同，与溶液的厚度和浓度无关。 上式写成以10为底的对数，Iog(I1/I0)=KLC ，再以透光度T=I1/I0时，则上式成为IogT= KLC或者IogT=KLC。I1/I0称为透光度或透 光率，表示透过光强度是入射光强度的百分之 几，其数值只能1，从0100%。为了方便起 见，经常用透光度的负对数IogT来表示溶液 吸收光线的情况，并称为吸光度(ABS)、消光度 (E)、或光密度(OD或D)，这样，ABS= KLC 该式说明溶液的吸光度和浓度C、厚度L之间皆 成正比关系。当厚度一定时，溶液的浓度增加 ，则吸光度成正比地增加，

5、这就是比色分析的 依据。实际使用中，溶液的厚度就是比色杯的 厚度，它是相对固定的，有0.5、1、2、4cm的 比色杯，使用最多的是1cm的比色杯。 比色分析中有时也用透光度做单位，根据透 光度的负对数IogT=吸光度，透光率为100% 时，吸光度=Iog1=0，而透光率为1%时，吸 光度=Iog0.01=2，二者间呈对数指数关系。 当然，只有溶液的浓度和吸光度之间成直线 正比关系时才能进行比色分析，如果溶液的吸 光度与浓度不成正比（不符合郎伯-比尔定律） ，则不能使用比色分析。有时，溶液的浓度只 在一定范围内和显色成直线正比关系，而浓度 超过一定限度时，失去正比关系，则不能一概 地用比色结果换

6、算，通常都要研究测定方法中 什么浓度范围内二者成直线正比关系；或者绘 制一系列浓度和吸光度之间的标准曲线，发现 浓度增加到一定限度，标准曲线发生弯曲、变 折，说明超过该浓度时，要对溶液进行稀释才 能用来比色分析。 可见光、紫外、荧光分析都要求溶液必须透 明，否则引起对光的吸收，影响分析的准确度 。 对特殊的均匀的浑浊液也可以进行比色分析,称 为比浊法，比如应用于红细胞计数、细菌计数 的比浊测定。 光线通过透明的溶液时，还有少量的光线在 玻璃、溶液的表面被反射或散射，影响到吸光 度，所以要用一个空白管进行校正，除去反射 、光、散射光、试剂中杂质、非反应物的影响 ，即用空白试剂溶液进行调零的原因。

7、普通玻 璃对紫外线也有吸收，所以在普通分光光度计 上 使用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度计上 必须用对紫外线无吸收的石英玻璃比色杯。 三. 可见紫外分光光度计的应用 （一）光谱分析：有时候需要研究某物质在 某溶剂中的光谱特性，如Vc的乙酸溶液在252.0 nm和237.5nm处有吸收波峰。 大多数情况下，比色分析都提供了使用光的 波长（一般是最大吸收峰波长）。如果没有提 供使用波长的话，可以用紫外分光光度计从200 1000nm范围内扫描吸收光谱，搜索到吸收峰 ，再用吸收峰波长来比色分析。 咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准 品；下：样品 （二）吸光系数：郎伯-比尔定律中的K称为吸 光

8、系数。因比色杯的直径用cm为单位，因此K 的单位决定于浓度c用什么单位，如c以mol/L为 单位时K称为摩尔吸光系数，用Emol或mol表示 ；如果物质的分子量未知，浓度可用%为单位 ，K称为百分吸光系数，用E%表示。 E的定义是：某波长光通过1cm杯、1mol/L或 1%浓度的某溶液时，该溶液对该波长光的吸光 度。E在特定波长、1mol/L或1%浓度、特定溶 剂条件下是该物质的一个特征常数，反映该物 质的吸光能力，资料和测定时都要标明其特征 波长或最大吸收波长，表示为Emolnm,max,1cm或 E%nm，max，1cm。许多物质的吸光系数在书或资料 中可以查到，如药典规定VB12应该有2

9、781 nm 、3611nm、5502nm 3个吸收峰，其E1%361nm， 1cm=207。实际工作中，1mol/L的浓度太高，可 以配成1mmol/L或1mol/L的浓度，相应地写成 Emmol（mol）nm，max，1cm。根据吸光系数的特性 ，它有3项用途： 1.可作为物质定性的参考：被测物质的光谱 特性和标准物如果一致，可粗略定性。如检查 VB12注射液是否变质，测定其光谱，结果为279 0、361.50、550.70.3nm3个吸收峰，完全一 致，可以判定该物质为VB12（未变质）。 一些苯衍生物的紫外光谱特征如下 ： 化合物 溶剂 吸收峰 吸收峰 吸收峰 Emolmax， 1cm

10、 苯 碳氢化合物254nm 250 204 8800 甲苯 碳氢化合物262 260 208 7900 六甲基苯 碳氢化合物 271 230 221 10000 氯苯 碳氢化合物 267 200 210 7400 苯酚 碳氢化合物 271 1260 213 6200 . 2.检查纯度：紫外光谱法检查纯度是一种简 便有效的方法，用于许多化合物检测。如阿司 匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司 匹林在280nm处有强吸收峰，而水杨酸的吸收 峰迁移到312nm，只要检测在312nm处是否有吸 收峰，即可判断有无水杨酸。再如无水乙醇精 制过程中要用苯，测定无水乙醇中是否残留苯 ，测定其吸收光谱，乙

11、醇在210 600nm之间无 吸收峰，而苯在250、254 nm有吸收峰，以纯无 水乙醇为参比，对样品进行光谱分析，如果在 250、254nm处出现吸收峰，则说明有苯残留。 3.检查含量（纯度）:如药典规定VB12的E1%max ，361nm，1cm=207，上述VB12注射液原标示浓度为 0.05%，求实际浓度，方法：药液用重蒸水精确 稀释20倍，水做参比，用361nm测定的吸光度 为0.512，其含量为：1%207=x%0.512 ， x%=0.00247%，浓度= 0.00247%20=0.049% 4.应用摩尔吸光系数测定浓度:一般的比色分 析中都有标准品，未知样品都是通过和标准溶 液

12、对比分析含量。某些情况下，没有标准品， 可以用摩尔吸光系数或百分吸光系数进行测定 ，直接测定溶液的吸光度，通过和该纯物质的 吸 光系数比较，可以计算出浓度。这样的分析需 要经过精确校正了波长的分光光度计，紫外分 光光度计的波长一般精确到2nm，可以承担这 样的分析。如果知道分子量的话，百分吸光系 数和摩尔吸光系数之间可以互相换算，换算公 式是：百分吸光系数=10摩尔吸光系数物质 的分子量。 比如血红蛋白是4个亚基组成的蛋白质，单个 亚基的平均分子量是16114.5。每个亚基都在高 铁氰化钾K3Fe(CN)6和氰化钾KCN溶液中形 成单体氰化高铁血红蛋白（HiCN），它的特征 （最大）吸收峰在5

13、40nm处，摩尔吸光系数是 11000，表示为Emolmax,540nm,HiCN=11000。 测定样品在同样条件下的吸光度，就可以计算 出含量。如：将血液0.02ml加入到5.0ml氰化高 铁试剂中，用540nm测定的吸光度为0.35，求血 液中Hb的含量(g/L)。第一步，计算血液稀释倍 数：5.020.02=251（倍）；第二步，计算： 1mol11000=x mol0.35，x=0.3511000 mol/L ，乘以分子量和稀释倍数变为g， x=0.351100016114.5 251=128.7（g/L）。 如果有些物质不知分子量，用它的1%溶液在同 样条件下测定，用百分吸光系数同

14、样可以换算 。 5. 紫外吸收光谱在某种程度上反映了化合物的 性质和结构，所以可以用于有机化合物的定性 和结构分析。利用标准样品或标准图谱可以对 未知化合物进行鉴定，即控制相同的测量条件 ，将未知化合物的吸收光谱与标准品或标准图 谱进行对照，如果两者吸收光谱的形状、吸收 峰的数目、位置、最大吸收波长及吸光强度完 全一致，则可说明它们分子结构中存在相同的 生色基团，初步确定它们是同一种物质，如咖 啡因的定性。 由于大多数有机化合物的紫外光谱比较简单， 缺乏精细的结构特征，而且很多生色团的吸收 峰几乎不受分子中其它非吸收基团的影响，因 此，仅根据紫外光谱鉴定有机化合物有很大局 限，一般必须与红外光

15、谱、质谱、核磁共振波 谱等相配合，才能进行精确的鉴定。 6. 溶剂对紫外光谱的影响：在测定有机物的 紫外可见吸收光谱时，在溶解度容许范围内， 应尽量选择非极性溶剂或极性较小的溶剂（烷 、烯烃，如正己烷、正庚烷），以获得吸收光 谱的精细结构。与标准样品或标准图谱进行对 比 时，必须用相同的溶剂。所选择的溶剂在所研 究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不 含有其它干扰物质；与溶质没有相互作用。否 则会使光谱线产生移动，低于此波长时，溶剂 的吸收不可忽略。 常用溶剂的波长范围如下： . 溶剂 使用波长范围 溶剂 使用波长范围 甲醇 210 二氯甲烷 235 . 乙醇 215 氯仿 245 . 水 210 乙酸乙酯 260 . 96%硫酸 210 苯 280 . 乙醚 215 甲苯 285 . （三）作为光度计使用：有色的反应液可以用 普通的分光光度计（721、722、浓度计），也 可以用紫外分光光度计比色。某些溶液、反应 液无色，在200400nm之间有特征性光吸收,就 只能用紫外分光光度计。 1.单一物质测定：先测定溶质的吸收光谱，一 般用最大吸收波长进行比色。常用方法有2种。 （1）标准曲线法：用标准液制作一系列标准 管的标准曲线，样品