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1、安徽医科大学 硕士学位论文 香兰素衍生物VND3207对粒子辐射损伤的防护作用 姓名：陈倩倩 申请学位级别：硕士 专业：病理学与病理生理学 指导教师：汪思应;周平坤 20100401 安徽医科大学硕士学位论文 陈倩倩，2010 年 4 月 7 摘 要 摘 要 电离辐射是由能直接产生电离的粒子或间接产生电离的粒子 （或二者的混合 粒子所组成。 电离辐射对生物体造成损伤可以通过辐射能量直接作用于生物分子, 导致 DNA，蛋白质等损伤，导致细胞凋亡，造成机体组织器官功能衰竭，如造 血组织功能减退，外周血白细胞数下降，消化、心血管系统功能降低，免疫系统 紊乱等；电离辐射还可以通过间接作用，即通过水在辐
2、射反应中产生的自由基、 活性氧（ROS）攻击核酸、蛋白质、生物膜等重要大分子并造成转录因子活化， 也导致细胞凋亡，基因突变，继发性肿瘤的发生，如白血病，放射性皮肤癌等。 辐射可分为电离辐射包括带电粒子（ 粒子、 粒子、质子等）和不带电粒 子（X 射线、 射线、中子等）；和非电离辐射包括光（可见光，红外线，紫外 线）和电磁辐射（微波、射频等）。基于辐射对机体危害极大，研究放射损伤防 治手段，寻找积极有效的防治药物具有重要意义。目前研究辐射防护剂机制包括 两个方面，其一促进 DNA 修复，抑制细胞凋亡如生长因子，蛋白酶抑制剂等， 但其毒副作用大，降低了临床价值；其二是抗氧化应激，降低 ROS 的生
3、成如含 硫化合物，酚类等，但作用浓度高，疗效低。因此，寻找一种无毒或低毒、高效 的辐射防护剂显得尤为重要。 天然化合物香兰素(3-甲氧基-4-羟基-苯甲醛)又名香草醛、香荚兰醛，因其具 有抗氧化和抗诱变的活性广泛应用于食品添加剂中。 有研究报道香兰素能清除 X 射线和紫外线诱导的 ROS，降低染色体畸变和细胞微核率，增强 DNA 修复，但 其作用浓度高，活性低。为此本课题组筛选出辐射防护作用更好的香兰素衍生物 丁香醛（Syringaldehyde，VND3207），前期试验已经证实 VND3207 比香兰素 更能有效的清楚自由基，降低辐射诱导的 DNA 损伤；同时，VND3207 对 射线 致
4、人正常细胞基因组损伤和细胞凋亡的有良好的保护作用，在实验动物水平上， VND3207 能增加 射线辐射后白细胞数，减少辐射后脾细胞凋亡率及微核形成 率。基于以上的理论和实验，本课题选用 粒子致辐射损伤的细胞模型，进一步 研究 VND3207 的抗辐射效应，并从细胞，分子水平探讨其作用机制。 （1）我们通过免疫荧光实验建立了 粒子损伤的细胞模型，结果提示与 射线相比， 粒子诱导的 -H2AX 簇集点为斑块状，损伤面积大，荧光强度强， 持续时间长，ImageJ 图像统计分析也得出相应的结论；同时，免疫荧光结果显 安徽医科大学硕士学位论文 陈倩倩，2010 年 4 月 8 示 粒子辐射后细胞内 p-
5、Chk-2 与 -H2AX 呈共同的亚细胞定位。提示 p-Chk-2 参与了 粒子辐射后 DNA 损伤修复反应。 （2）我们通过 MTT 实验检测了香兰素衍生物 VND3207 对正常细胞的影响。 结果表明经 0-100mol/L VND3207 处理的细胞，增值能力无明显变化，同时与 DMSO 对照组相比，细胞的增殖无明显变化，提示 VND3207 在 0-100mol/L 对 正常细胞无明显毒性。 （3） 我们通过细胞克隆形成实验表明无论是照射前还是照射后给与一定浓 度的 VND3207 药物，均能增强细胞对粒子的辐射损伤抗性。同时，在不同剂 量照射下，50mol/L 的 VND3207
6、均可以提高细胞的辐射敏感抗性，照射前用药 效果比照射后用药更好， 反映出本课题以前报道的 VND3207 清除自由基的作用， 由此减轻了辐射对 DNA 的间接损伤效应。此外 Annexin 标记结合流式细胞术 检测显示 50mol/LVND3207 对受照细胞凋亡的发生有较好的防护作用 （4）DNA双链断裂是电离辐射致细胞最严重的损伤形式。中性单细胞凝胶 电泳结果表明，VND3207能明显减轻2.0Gy粒子诱导的DNA双链的断裂率，并 呈药物依赖关系；同时50mol/L的VND3207能有效降低2.0Gy粒子辐射后不同 时间点的DNA原位损伤。微核试验表明，20mol/L以上浓度VND3207
7、保护下辐 射细胞的微核率显著下降； 免疫荧光及Western 印迹实验也是显示VND3207有效 地降低了0.5Gy粒子致细胞核内-H2AX的表达。 （5）当DNA发生断裂损伤时，机体就会启动DNA的修复机制。Western blot 检测了粒子辐射后细胞内修复蛋白的表达，结果显示5-100mol/L的VND3207 能有效的提高粒子辐射后p-DNA-PKcs（S2056）的表达，但是对p-Chk-2的表达 无明显变化。同时，免疫荧光结果表明50mol/LVND3207可以增加粒子辐射后 NF-B的核易位，从而抵抗辐射诱导的细胞凋亡。 综上所述，VND3207对正常细胞无明显毒性，并能够有效增
8、强粒子辐射后 细胞的辐射敏感抗性，提高细胞抗凋亡能力，保护辐射诱导DNA损伤，维护细 胞基因组稳定性，增加修复蛋白的表达。因此，VND3207有开发成为抗辐射新 药的价值，并成为临床治疗放射性疾病提供理论依据。 关键词关键词：电离辐射/DNA损伤/香兰素衍生物/粒子/凋亡/微核 安徽医科大学硕士学位论文 陈倩倩，2010 年 4 月 9 ABSTRACT Ionizing radiation is consisted with particles, which produced ionization directly or indirectly （or a mixture composed o
9、f particles).The injure on living organisms from ionizing radiation can cause damage directly by radiation energy in biological molecules,which lead to DNA, proteins damage, incident of apoptosis, organ failure, such as hematopoietic dysfunction, the number of peripheral white blood cells decreased,
10、 digestive or cardiovascular system function reduced ,immune system disorders, etc; ionizing radiation can also produced an indirect effect of radiation through the free radicals or reactive oxygen species (ROS)produced in water reaction, which can attack DNA, proteins, biofilm, and other important
11、molecules and cause activation of transcription factors, this injure also lead to apoptosis, gene mutation, the incident of secondary tumors, such as leukemia, radiation-induced skin carcinoma. Radiation can be divided into ionizing radiation and non-ionizing radiation. Ionizing radiation include ch
12、arged particles ( particles, particles, protons, etc.) and non-charged particles (X-rays, rays, neutrons, etc.); and non-ionizing radiation include light (visible, infrared, ultraviolet) and electromagnetic radiation (microwave, radio frequency, etc.). Based on great harm of radiation on the body, w
13、e should find effective drug against radiation injure. At present, the mechanism of radioprotective agents includes two aspects, one is to enhance DNA repair, inhibit the incident of apoptosis, such as growth factors, protease inhibitors, but these agents had toxic side effects and reduced the clini
14、cal value; the other mechanism is to resist oxidative stress, decrease ROS generation, such as sulfur compounds, phenols, etc., but these drug need high concentration and had low efficacy. Therefore, To search a non-toxic or low toxicity and efficient radioprotective agents is particularly important
15、. Natural compound vanillin (3-methoxy-4-hydroxy -benzaldehyde), also known as vanillin or vanilla aldehyde, is a food-flavoring agent with antioxidant and anti-mutagenic activities. It has been shown that vanillin can reduced ROS, chromosome aberrations and cells micronucleus ,and it could also enh
16、anced DNA repair induced by X-ray and ultraviolet .but its effect of radioprotection need high 安徽医科大学硕士学位论文 陈倩倩，2010 年 4 月 10 concentration and its activity is very low. So, our group synthesized derivative of vanillin named Syringaldehyde, (VND3207), which have a good effect of radioprotection. Preliminary tests have confirmed that VND3207 has more effe
