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1、痛泻要方对IBS模型血清内源性物质代谢干预实验探究 摘要通过代谢组学评价痛泻要方对肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）大鼠模型血清内源性物质代谢干预效应，寻找潜在的生物标志物并分析其代谢途径，探讨痛泻要方的作用机制及病证模型的证候本质。将40只Wistar大鼠复制为IBS模型，随机分为模型对照组和痛泻要方给药组4组，另设空白对照组10只。痛泻要方（低、中、高）组分别灌胃剂量为0.203，0.406，0.812 gmL-1的痛泻要方，空白对照组及模型对照组给予等体积的生理盐水，每日1次，连续2周。各组大鼠于灌胃第0，15天采集血清，经处理后供UPLC-Q-TO
2、F-MS进行代谢组学分析。鉴定出8个潜在生物标志物，分析出8条主要代谢通路，其与IBS疾病的神经递质代谢、炎性免疫、脑神经功能及能量代谢等有关，痛泻要方对IBS疾病的作用机制可能涉及血清素突触和色氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、甘油磷脂代谢、烟酸和烟酰胺代谢等过程，其可能是IBS模型肝旺脾虚证的生物学基础 关键词 痛泻要方； 肠易激综合征； 肝旺脾虚； 内源性代谢物； 代谢组学 Abstract To evaluate the effect of Tongxie Yaofang on cardiac endogenous metabolism in irritable bowel syndr
3、ome（IBS） rats by using metabolomics method， find its potential biomarkers， analyze the metabolic pathways， and explore the pharmacological effects， mechanisms of action and syndrome essence of syndrome model. Forty Wistar rats were used to establish IBS models， and then randomly divided into four gr
4、oups： model control group and Tongxie Yaofang treatment groups （high， medium， low dose）. Another 10 rats were used as normal group. The rats in Tongxie Yaofang-treated（low， medium and high dose） groups were orally administrated with Tongxie Yaofang extracts once a day for 2 weeks， respondingly with
5、the doses of 0.203，0.406，0.812 gmL-1. The rats in normal group and model control group were given with equal volume of saline once a day for 2 weeks. On the 0 and 15th days， serum was collected and each sample extract was analyzed by UPLC-Q-TOF-MS. Eight potential biomarkers were identified and 8 ma
6、jor metabolic pathways were found to be related with IBS diseases neurotransmitter metabolism， inflammatory immunity， brain function and energy metabolism， etc. Tongxie Yaofang had certain pharmacological effects on IBS， and its mechanism may be related to serotonergic synapse， tryptophan metabolism
7、， cysteine and methionine metabolism， glycerophospholipid metabolism， nicotinate and nicotinamide metabolism and so on， which might be the biological basis of IBS liver-spleen deficiency syndrome. Key words Tongxie Yaofang； IBS； liver stagnation and spleen deficiency； endogenous metabolites； metabol
8、omics 本研究M在前期工作中已进行了较深入的痛泻要方对肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）大鼠模型脑-肠互动效应机制影响的研究1-2，并对其作用机制有一定阐释。对机体、病证的作用机制仅通过某些作用靶点、机制、通路来阐释机体证候复杂性、方药成分有效性的研究模式，是不能完全将药物对病证的作用机制阐明清楚。而如何全面、系统的阐明方药对病证整体效应，值得思考。代谢组学通过机体内小分子代谢产物整体变化规律，还原相关联的生物事件，以揭示机体的生物状态实质和药物作用机制3。代谢组学具有整体动态、综合与分析等系统方法学特点，有与中医治疗疾病的整体观念相近的特点4。方药则
9、可对机体代谢途径中某些环节作用特异性强，干预其代谢产物及代谢网络5。通过代谢组学与中医方证相结合，从体内代谢产物的角度明晰方药代谢网络干预效应，而明确对动物模型的作用机制及实质。因此，本实验将IBS病证结合模型和代表方药痛泻要方作为有机系统进行研究，通过痛泻要方对IBS动物模型血清内源性代谢物干预效应的评价，研究其对IBS病证模型调控差异、调控效应，发掘出其生物标记物，建立其代谢模式特征，通过基于体内作用的物质质量变化规律以探求痛泻要方的作用本质及所适应病证模型的证候本质。 1 材料 高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱系统（UPLC-Q-TOF-MS系统），包括Waters AcquityTM
10、 Ultra型高效液相色谱仪，Triple TOF 5600+型飞行时间质谱仪，MassLynxV4.1工作站（Waters公司，美国）；电喷雾离子源（AB SCIEX公司，美国）；KDC-40型低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司，中国）；D-78532型Tuttligen离心机（Hettich公司，德国）；Vortex3000型旋涡混合机（wiggens公司，德国）；Academic纯水制备系统（Milli-Q公司，美国）；Forma 995型超低温冰箱（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；B3200S-T型超声震荡仪（必能信超声上海有限公司，中国）；KDC
11、-160HR型高速台式冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司，中国）；SK-1型快速混匀器（江苏医疗仪器厂，中国）；cp2465型血管成形术球囊（EV3公司，美国）；E206Fr型儿童导尿管（3 mL，沈阳市博斯林医疗器械有限公司，中国）；DYM型硬膜外麻醉导管（1.01，扬州华夏医疗器械有限公司，中国） 痛泻要方源自丹溪心法，炒白术（Atractylodis Macrocephalae Rhizoma），炒白芍（Paeoniae Radix Alba），炒陈皮（Citri Reticulatae Pericarpium），炒防风（Saposhnikoviae Radix），上述样品由黑龙
12、江中医药大学药学院孙慧峰教授鉴定。精准称量白术81 g，白芍54 g，陈皮40.5 g，防风27 g（6432），生药用10倍蒸馏水浸泡0.5 h，加蒸馏水煎煮2次。第1次煎煮1.5 h，第2次煎煮1.0 h，然后将2次滤液合并，过滤杂质，水浴加热浓缩滤液，提取液减压浓缩得到100 mL浓缩液，药物提取物收率为2.03 gmL-1。制成冻干粉末后以HPLC测定主要成分白术内酯，白术内酯，白术内酯，芍药苷，质量分数分别为0.043 8，0.031 4，0.154 5，0.234 1 mgg-1。4 保存待用。临用时以蒸馏水配制成生药浓度为0.203（临床等效量），0.406，0.812 gmL-
13、1的药液 乙腈（色谱级，Thermo Fisher Scientific公司，美国，A998-4）；甲醇（色谱级，Dikma Technologies公司，美国，CAS-67-56-1）；甲酸（色谱级，Tedia公司，美国，FS0630-015）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料公司，中国，GB19298） 2 方法 2.1 IBS模型复制、分组及给药 Wistar大鼠，清洁级，雌雄兼用，出生8 d，体重（112）g，购于黑龙江中医药大学（黑动字第P00102006）。大鼠自由进食饮水，室温2124 ，湿度50%60%。采用乳鼠直肠扩张刺激法6结合母婴分离法7，母鼠与其乳鼠共同饲养在笼内，乳鼠第81
14、2天以血管成形术球囊（囊长15 mm）插入直肠，至球囊末端距离肛门2 cm，缓慢逐渐地向球囊注水以扩张肠道，2次/日，每次持续1 min，2次间隔30 min。第1317天，以囊长20 mm的血管成形术球囊扩张直肠，其余条件不变。第1821天改为儿童导尿管扩张直肠，注入水0.1 mL，其余条件不变。每天乳鼠直肠扩张后，单独放入其他笼内，与母鼠分离1 h，之后再与母鼠同放笼内。造模2周。通过腹部撤离反射实验（AWR）评价模型，评价成功者为成模的IBS模型。将成模的IBS大鼠按体重随机分为4组，分别为模型对照组（M）、痛泻要方高（G）、中（Z）、低（D）3组，各组10只，另设正常对照组（K）10只
15、。痛泻要方G，Z，D 3组每天分别灌胃给予8.12，4.06，2.03 gkg-1痛泻要方药液。正常对照组、模型对照组按等体积灌服生理盐水。每组给药2周 2.2 生物样本采集及处理方法 实验造模第0，15天眼底采血2 mL，4 下3 000 rmin-1离心10 min，取上层血清。作为不同时间点血样。置于-80 冰箱保存备用。样品常温解冻，取血清100 L，加入400 L甲醇以稀，涡旋2 min以混匀充分，在4 条件下3 000 rmin-1离心15 min，以沉淀蛋白，吸取200 L上层血清再加入10 L内标（1 gmL-1氯苯丙氨酸水溶液），以3 000 rmin-1涡旋2 min，吸取
16、上清液放置于玻璃进样小瓶以备用 2.3 代谢组学数据采集 进样分析。色谱条件：Rapid Resolution色谱柱（2.1 mm100 mm，1.8 m）；流速0.4 mLmin-1；柱温30 ；扫描范围190400 nm；检测波长210，254，280 nm；进样量2 L；流动相0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱，03 min，98%48%A，310 min，48%2%A，1012 min，2%98%A，1214 min，98%A。质谱条件：正/负离子一级质谱（MS）条件为ESI（电喷雾离子源），LockSprayTM校正系统进行在线质量校正，扫描检测m/z 50/1 500，扫描时间0.2 s，毛细管电压3.00 kV，样品锥孔电压35 V，提取电压4.0 V，离子源温度120 ，脱溶
