1 光谱分析 原子光谱 原子吸收 原子发射 原子荧光 分子光谱 分子吸收 紫外-可见光谱 红外光谱 分子发光 2 第二章 分子发光分析 分子吸收能量 激发为激发态释放出能量基态 电能化学能光能 称为“发光” 光的形式释放 荧光磷光 分子发光 光致发光 化学发光 辐射跃迁非辐射跃迁 以热的形式释放 分子荧光分析法 一、基本原理 （一）荧光和磷光的产生 从分子结构理论来讨论 3 分子中电子 的能量状态 电子所处的能级 振动能级 转动能级 电子的多重态 J=2S+1 S：为各电子自旋量子 数的代数和 S=0, J=1 单重态S表示 （所有电子都是自旋配对的） S=1, J=3三重态 T表示 大多数基态分子都处于单重态 电子在跃迁过程中伴随着 自旋方向的变化（自旋平行） 4 基态单重态S 激发态单重态S 激发态三重态T 激发单重态S与激发三重态T的不同点： ⑴ S是抗磁分子，T是顺磁分子 ⑵ tS = 10-8s, tT = 10-4～1s；(发光速度很慢) ⑶ 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁， 基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁； ⑷ 激发三重态的能量较激发单重态的能量低 5 其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态 T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级 2．分子内的光物理过程 6 S0 S1 S2 T1 吸光1吸光2 振动弛豫: 在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的 形式发出发生 振动弛豫的时 间为10-12s数量 级 非辐射能量传递过程； 7 S0 S1 S2 T1 吸光1吸光2 内转移: 当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重 叠时， 常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级 （S1 转移 S2） 8 S0 S1 S2 T1 吸光1吸光2 荧光3 系间窜跃: 指不同多重态间 的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一 种系间窜跃 通常，发生系间 窜跃时，电子由S1 的较低振动能级转 移至T1的较高振动 能级处 9 辐射能量传递过程 荧光发射: 电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态 S0 S1 S2 T1 吸光1吸光2 荧光3 荧光 得到最大波长为λ3的荧光 由图可见，发射荧光的能量 比分子吸收的能量小 λ3 λ2 λ1 10 磷光发射: 电子由基态单重态激发至第一 激发三重态的几率很小，因为这 是禁阻跃迁 但是，由第一激发单重态的最 低振动能级，有可能以系间窜跃 方式转至第一激发三重态，再经 过振动驰豫，转至其最低振动能 级，由此激发态跃回至基态时， 便发射磷光， 这个跃迁过程（T1→S0）也是自 旋禁阻的，其发光速率较慢，约 为10-4-10s。
因此，这种跃迁所发 射的光，在光照停止后，仍可持 续一段时间 S0 S1 S2 T1 吸光1吸光2 荧光3 磷光 磷光 外转移 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子 的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强 度减弱甚至消失这一现象称为“熄灭”或“猝灭” 荧光与磷光的根本区别： 11 磷光是由激发三重态最低振动能层至基态 荧光是由激发单重态最低振动能层至基态 区别 (二 )荧光的激发光谱和发射光谱 激发光谱:(ex) 以不同波长的入射光激发荧光物质,在荧 光最强的波长处测量荧光强度 即以激发光波长为横坐标,以荧光强度为 纵坐标绘制曲线即可得到激发光谱曲线 发射光谱：(em) 固定激发光波长（最大） 然后测定不同的波长时所发射的荧光强度 即可绘制荧光发射光谱曲线 12 在荧光的产生过程中，由于存在各种形 式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的 最大发射波长都向长波方向移动，以磷光 波长的移动最多，而且它的强度也相对较 弱 13 14 15 激发光谱与发射光谱的关系 a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值发射光谱的波长比 激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量 b. 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级 图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最 低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。
（三）荧光的影响因素 分子产生荧光必须具备两个条件： ① 分子必须具有与所照射的辐射频 率(紫外-可见光）相适应的结构（共 轭双键），才能吸收激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的 能量之后，必须具有一定的荧光量 子产率 16 1.荧光效率 它表示物质发射荧光的能力，通常用下 式表示 17 荧光效率越高；物质发射荧光越强 kf为荧光发射过程的速率常数（与化学结构有关） ki为其它有关过程的速率常数的总和（化学环境） 凡使kf 值升高而使ki值降低的因素，都可增强荧光 2. 荧光与有机化合物结构的关系 （1）跃迁类型 实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历 激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃 迁，再发生 跃迁而得到荧光 （2）共轭效应 实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物 容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般 也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光 系数，有利于产生更多的激发态分子 18 (3) 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的 有机分子具有强烈的荧光 因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用 减少，也就减少了碰 撞去活的可能性。
19 20 （4）取代基效应 芳环上 取代基 给电子基团，荧光增强（-OH、-OR、-CN、-NH2） 产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低 激发单重态与基态之间的跃迁几率增大 吸电子基团减弱甚至会猝灭荧光 如-COOH、-NO、-C O、卤素 卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低 在重原子中，能级之间的交叉现象比 较严重，因此容易发生 自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速率 3. 金属螯合物的荧光 大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能 发生无辐射跃迁，因而不产生荧光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由 于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光 但是，若这些化合物和金属离子形成螯 合物，随着分子的刚性增强，平面结构的 增大，常会发生荧光 21 22 23 同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度 可能有明显不同 4．溶剂效应 一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π* 跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移 5 ．温度的影响 一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低， 荧光效率和荧光强度将增加 如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10 ℃， 荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光效率为100%。
（四）溶液的荧光（或磷光）强度 1. 荧光强度与溶液浓度的关系 荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量 子产率 If = Ia 式中为荧光量子效率，又根据Beer定律 A=-lg I/ I0 I= I0 .10- A Ia = I0 - I = I0(1- 10 -A) I0和I分别是入射光强度和透射光强度代入上式得 If = I0(1- 10 -kb c) 24 整理得： If =2.3 I0 kbc 当入射光强度I0 和b一定时，上式为： If = K c 即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比， 但这种线性关系只有在极稀的溶液中， 当 kbc0.05时才成立 对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度 和浓度不呈线性关系 25 26 2 、影响荧光强度的环境因素 因素 溶剂 一般溶剂效应 折射率和介电常数的影响 特殊溶剂效应 荧光体和溶剂分子间的 特殊化学作用如氢键的生成 同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同 温度 温度上升使荧光强度下降 内部能量转化作用增大 碰撞频率增加，使外转换的几率增加 酸度 化合物所处状态不同 电子构型上有所不同 荧光强度和荧光光谱不同 27 28 3、荧光猝灭 定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子 的相互作用引起荧光强度降低的现象 类型 碰撞猝灭 激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞 荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态 静态猝灭 荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的络合物 转入三重态的猝灭 发生电子转移反应的猝灭猝灭剂与荧光物质 荧光物质的自猝灭 浓度较高单重激发态的分子在发生荧光之前和未 激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭 溶解氧与荧光物质 29 光源 氙灯和高压汞灯 激发单色器 光栅 扫描激发光谱，选择激发波长 样品池 I0 I If 发射单色器 扫描发射光谱 消除其它光线的干扰 获得所需的荧光 检测器显示器 与分光光度计的差别 两个单色器 两个单色器互成直角 光电倍增管 二、荧光分析仪 30 三、分子荧光分析法及其应用 1. 荧光分析方法的特点 （1）灵敏度高 （2）选择性强 （3）试样量少和方法简单 （4）提供比较多的物理参数 2、荧光定量分析的方法 方法 标准曲线法 荧光强度与荧光物质浓度成正比的关系 比较法 同样条件下，测定试样溶液和一标准溶液 的荧光强度，直接通过比例计算 31 3、荧光分析法的应用 方法 直接荧光法 被测物本身有荧光 被测物与试剂反应后 F与物质的 浓度成正比 荧光猝灭法 被测物使荧光熄灭 由荧光强度降低的强度来测定被 测物的含量 间接荧光法 某些阴离子夺取金属络合物中金属 离子，而释放出能发荧光的配位体 催化荧光法 反应速度慢，荧光微弱，难测定 金属离子将加速反应进行 32 磷光分析法 1．如何获得较强的磷光 增加试样的刚性: 低温冷冻 固体磷光法：吸附于固相载体（滤纸） 分子缔合物的形成：加入表面活性剂等 重原子效应：加入含重原子的物质，如银盐等 敏化磷光：通过能量转移产生磷光 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级 →基态， T1 → S0跃迁； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） 33 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。
在有荧光发射的同时测量磷光 磷光分析仪器 应用 34 化学发光分析法 一、基本原理 A +B → C + D* D* → D + h 某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时， 发射出一定波长的光 （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物 （2）发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170～300 kJ/mol；位于可见光区 （3）发光持续时间较长，反应持续进行 发光反应如果存在于生物体(萤火虫)中，称生物发光 35 化学发光效率 化学效率： 发光效率： 化学反应所决定 化学反应和环境因素 化学发光强度(单位时间发射的光量子数)： dc/dt是分析物参加反应的速率 36 若化学发发光反应是一级动力学反应则 即发光总强度与被测物浓度成线性： 二、化学发光反应类型 1. 直接化学发光和间接化学发光 直接发光 是被测物作为反应物直接参加化学发光反应 ，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子 A + B C* + D C* C + h 37 间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产 物C* ， C* 不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁 回基态，产生发光。
A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h 2. 气相化学发光和液相化学发光 （1）气相化学发光 化学发光反应在气相中进行 主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的 O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等 NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h 38 （2）液相化学发光 化学发光反应在液相中。