《靶向抗肿瘤耦联物苯丙胺酸氮芥—己二酸桥—偕二磷酸的靶向性及疗效实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《靶向抗肿瘤耦联物苯丙胺酸氮芥—己二酸桥—偕二磷酸的靶向性及疗效实验研究（146页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、四川大学 博士学位论文 靶向抗肿瘤耦联物苯丙胺酸氮芥己二酸桥偕二磷酸的靶向 性及疗效实验研究 姓名：李伟 申请学位级别：博士 专业：外科学（骨科） 指导教师：裴福兴 20070415 英文缩写词一览表 英文全称 t h i a z o l y lt e t r a z o l i u mb r o m i d e e m i s s i o nc o m p u t e dt o m o g r a p h y o p t i c a ld e n s i t y i n f r a r e ds p e c t r u m m a s ss p e c t r o g r a p h y a
2、 l k a l j n ep h o s p h a t a s e D u l l b e c c o sm o d i f i e dE a g k Sm e d i u m d i m a t h y ls u l f o x i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d F e t a lb o v i n es e r u m f l o wc ”o m e t r y h e m a t o x y l i n - e o s i ns t a i n i n g P r o p i d i u mi
3、 o d i d e r o u n dp e rm i n u t c p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t u m o rt on o n - t u m o rr a t i o r e , o n o fi n t e r e s t T a r g e t e dd r u gd e l i v e ws y s t e m T r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e P h o s p h a t eb u f f e r e d 轴1 i n e I I
4、i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o j r a p h y 中文名称 四甲基偶氮唑盐 发射计算机体层摄影 光密度 红外光谱分析 质谱分析 碱性磷酸酶 培养基 二甲基亚砜 乙二胺四乙酸 胎牛血清 流式细胞仪 苏木素一伊红染色 碘化丙啶 每分钟转速 多聚酶链式反应 肿瘤非肿瘤比值 感兴趣区 靶向药物传递系统 透射电镜 磷酸盐缓冲液 高效液相色谱 一m时m|呈脚一一一|耋删詈|H 呻呱椰姗一|耋一 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文
5、中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论 文成果归四川大学所有，特此声明。 申请人 指导教师 穆哗 形纡 叫川人学博l 学位论文 靶向抗肿瘤耦联物苯丙胺酸氮芥一 己二酸桥一偕二膦酸的靶向性及疗效实验研究 研究生：李伟 导师：裴福兴教授 中文摘要 目的：本研究的目的在于开发一种新型的靶向抗肿瘤药物，将亲骨性载 体二膦酸盐与化疗药物苯丙胺酸氮芥耦联，并将放射性核素1 5 3 S m 与耦 连
6、物鳌合，合成一种双膦酸盐和亲骨核素为导向、化疗药物和8 射线协 同发挥作用的骨肿瘤靶向治疗系统，特异性识别、杀灭恶性骨肿瘤细胞， 全身其它非靶向脏器药物浓度低，毒副作用小，达到高效低毒治疗骨肿 瘤的目的。并通过体内体外实验验证合成耦联物的生物效应，为以后的 临床试验用药提供理论依据。 方法：( 1 ) 耦连物的合成及鉴定：将苯丙胺酸氮芥与二膦酸盐耦联，”3 S m 与耦联物鳌合，合成新的耦联物，采用核磁共振仪、红外光谱仪、质谱 分析，确定其组分、相对含量及结构鉴定；羟基磷灰石晶体吸附实验和 荷瘤鼠体内分布显像实验，了解耦联物体内外的亲骨性能。( 2 ) 耦联物的 细胞毒性实验：体外培养观察不同
7、浓度的耦连物对成骨细胞的影响； 采用M I T 、细胞活力分析、丫啶橙染色、流式细胞术、扫描电镜，观 察不同浓度的耦连物对M G - 6 3 细胞增殖和凋亡的影响。( 3 ) 裸鼠体内耦连 物抗肿瘤实验研究：用T 免疫计数仪、高效液相色谱仪分析测定靶组 织( 骨、肿瘤) 和非靶组织( 心、肝、肾) 药物浓度，研究偶联物在小 四川大学博：t 学位论文 鼠体内的动力学分布规律和骨靶向性；不同浓度耦连物对肿瘤的影响， 计算抑瘤率；R T - P C R 和W e s t e r nb l o t 法，检测实验组和对照组c a s p a s e 3 基因、C m y c 基因表达差异。 结果：( 1
8、 ) 耦连物的合成及鉴定：对合成的耦联物结构进行核磁共振波谱 分析，得出的光谱数据符合药物合成的要求；耦联物在体外对羟基磷灰 石具有良好的吸附性能，在体内骨骼系统和血流丰富的脏器，尤其是肿 瘤部位高度浓聚。( 2 ) 耦联物的细胞毒性实验：不同浓度的耦联物对成 骨细胞的贴壁率、体外克隆形成及细胞活力无明显影响，M T r 实验显 示耦联物各浓度组的成骨细胞O D 值逐日增高，各组之间无统计学差异 ( P 0 0 5 ) 。M G 6 3 骨肉瘤细胞M T r 实验显示：不同浓度的耦联物及 苯丙胺酸氮芥作用下的骨肉瘤细胞，经过2 4 到9 6 小时培养后，O D 值 均减小，其中2 0 0 0
9、u g m l 浓度的耦联物组及阳性对照组在同一时间有显 著性差异( P O 0 5 ) ；2 4 小时，4 0 0 n v J m t 、 2 0 0 0 u g m i 组与阳性对照组间有显著性差异( P 0 0 5 ) 。 表3 成骨细胞在不同浓度耦联物0 t g m 1 ) 中的不同时同( 小I I ；I ) O D 值变化 浓度、时间2 44 87 29 6 1 2 0 2 0 0 0n 1 0 9 - 1 ：0 0 1 30 1 6 1 ：t ：0 0 1 2n 1 8 0 ：b 00 1 3 4 0 0 0 1 0 7 ：t ：0 0 0 90 1 6 3 ：- 0 0 1 20
10、 1 8 4 - a ：0 0 2 00 2 0 7 ：t ：0 0 1 9 n 2 1 2 士0 0 2 l 柏01 1 3 1 = 0 0 0 80 1 8 1 ：t ：O 0 1 4 0 I g S - a ：0 0 2 1 0 2 1 3 - 0 0 兹0 2 2 3 = 1 ：0 0 1 8 401 0 7 ：t ：00 0 80 1 7 9 - A O 0 1 30 1 8 1 ：1 ：0 0 1 9 0 2 1 8 = 1 ：0 0 2 40 2 2 4 a ：0 0 1 5 阳性对照0 0 0 1 = t ：0 0 1 30 0 0 2 4 ：0 0 0 50 0 0 4 ：t
11、 ：00 0 6 0 0 0 5 ：J ：0 0 0 4O 0 0 2 a ：0 0 0 5 阴性对照 0 1 1 5 i 0 0 1 20 1 7 5 a ：0 0 80 1 8 6 = 1 = 0 0 1 3 0 2 1 2 = 1 = 0 , 0 2 1O 2 2 1 ：1 ：0 0 2 1 窒旦翌墨! ：竺竺：竺! ：竺竺竺：! 丝 ! ：! ! ! 竺：竺! ：! ! ! 竺：塑! ：坐竺! 图2 成骨细胞在不同浓度药物作用下的生长曲线 4 讨论 化学药物治疗恶性肿瘤的过程中，特别是化疗的中晚期，由于严重 的毒副作用，而不得不推迟疗程或减少用药量，影响了临床应用。靶向 给药体系是由于
12、其高效低毒的特点，成为目前抗肿瘤药物研究领域的热 点之一。其中以靶向治疗的载体物质为一个关键点。在骨肿瘤的主动靶 叫川I 大学博l 学位论文 向治疗方面，出现了许多趋骨性载体，偕二磷酸化合物就是其中较好的 一类I s 9 J 。 二膦酸盐通过化学方法同苯丙胺酸氮芥合成一种新的抗骨肿瘤靶向 耦联物。 以期新合成的药物同时具备良好的亲骨性和杀灭肿瘤的能力，以达 到治疗目的；同时，降低药物对人体器官的毒性作用，该耦联物的靶向 部位为骨组织的肿瘤，在对肿瘤细胞作用的同时但对正常成骨细胞无明 显的毒副作用。通过药物体外细胞毒性实验，可以准确反应细胞在药物 作用下的增殖和功能变化。 研究表明【l o l
13、，偕二磷酸盐不被代谢，肾脏是唯一的消除途径，它在骨 中的半衰期相当长。在骨组织内，已有明确的证据表明偕二磷酸盐可以抑 制破骨细胞的功能并促进其凋亡【l l l ；对于成骨细胞，实验研究证明【1 二1 4 1 治疗剂量的偕二磷酸盐可以促进成骨细胞的增殖分化及骨组织的形成。 耦联物的另一组成部分苯丙胺酸氮芥在进入体内后全身分布，肝肾组织 中含量最高，主要以原形通过肾小球过滤，经肾脏外捧。长期应用最常 见的不良反应为肝肾损害、骨髓抑制。 M T I “ 法是检测细胞存活和生长能力的方法，具有高灵敏度及重复性 好的特点，可以灵敏地反应细胞受损地情况。本实验中发现，在各浓度 组耦联物地作用下，培养2 4
14、 9 6 小时的成骨细胞，其M T F 值逐日增加， 实验组与阴性对照组无显著性差异，而与阳性对照组有显著差异，说明 培养的成骨细胞生长状况良好，适量浓度的耦联物对其生长无影响。但 也可以看到9 6 、1 2 0 小时高剂量组O D 值小于其它组。说明大量的耦连 物对成骨细胞生长还是有一定的影响。 克隆形成试验是检测单个细胞增殖能力的有效方法，克降形成试验 是评价抑制肿瘤细胞增殖作用的简便而可靠的指标。通过计算细胞克隆 形成率可对单个细胞的增殖能力作定量分析，并了解细胞的增殖率，观 5 1 列川大学博士学位论文 察细胞在不同浓度耦联物作用下的分裂增殖生长能力的交化。该法适合 于贴壁培养细胞。本
15、实验中，各浓度耦联物作用下的成骨细胞在体外增 殖形成的克隆数与对照组无明显差异，说明新合成的耦联物对成骨细胞 的生长无明显的影响。 细胞活力分析法能够定量的较为准确的测定药物对细胞活力的影 响。细胞活力分析结果同样表明新合成的耦联物对成骨细胞的生长无明 显的影响。 5 小结 1 ) 新合成的耦联物在不同浓度作用于体外培养的成骨细胞，未见成骨 细胞的生长受到影响，耦联物对成骨细胞未见明显的细胞毒性作用， 为下一步的实验提供了理论依据。 2 ) 本实验研究中，在2 0 0 0 # g m l 浓度的耦联物作用2 4 小时后，细胞活 力降低，随着作用时间的延长活细胞减少，说明可能耦联物浓度过 大，对
16、正常细胞的毒性增强，导致成骨细胞贴壁生长障碍，造成细 胞死亡。但在4 0 0 弘g m t 浓度耦联物作用下的成骨细胞培养2 4 9 6 小时，细胞活力与空白对照组无明显差异，说明该浓度较合适，不 会对正常细胞起杀伤作用。 参考文献 1 1 m0 1 , Q u r e s h iS A , K e n n e yJ ，R u b a s hH E , S h a n b h a gA S O s t e o b l a s ! p r o l i f e r a t i o n a n dm a t u r a t i o n b yb i s p h o s p h o n a t e s B i o m a t e r i a l s 2 0 0 4 A u g ；2 5 ( 1 8 ) ：4 1 0 5 - 4 1 1 5 2 P a nB ，T oL B ，v a r r u g i
