《靶向抗肿瘤egflinkertcskdel融合蛋白的研制及其生物活性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《靶向抗肿瘤egflinkertcskdel融合蛋白的研制及其生物活性研究（97页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、南方医科大学 博士学位论文 靶向抗肿瘤EGF-Linker-TCSKDEL融合蛋白的研制及其生物活性 研究 姓名：杨海文 申请学位级别：博士 专业：肿瘤学 指导教师：罗仁 20080426 博士学位论文 靶向抗肿瘤E G F - L i n k e r T C S K D E L 融合蛋白 的研制及其生物活性研究 博士研究生：杨海文 指导教师：罗仁教授 摘要 肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一，寻找有效的抗肿瘤药物与 方法是当今世界医学界的重要研究课题。研究表明，许多中药具有抗肿瘤作用， 但其作用成分复杂，具有多种作用成分和通过多种作用途径产生抗肿瘤作用。 弄清中药的抗肿瘤作用途径和靶位
2、点对加速抗肿瘤中药的开发具有重要意义。 近5 0 年来尽管肿瘤治疗取得了一些进展，化疗、放疗、手术仍是治疗基本手段。 但是由于现有的化疗药物和放疗的选择性不高，杀伤肿瘤细胞的同时也损害体 内正常细胞，治疗中常出现较明显的毒副反应，研究、开发一种对肿瘤细胞选 择性高、杀伤作用强且对正常组织副作用小的抗肿瘤药物非常有意义。免疫毒 素是提高治疗效果的一条重要途径，也是新一代的癌症治疗方法，此疗法与传 统的化疗不同，其药物能在肿瘤部位有相对较高的浓度，存留较长时间，对肿 瘤靶细胞有较强的杀伤活性，而对正常细胞无作用或毒性很小。免疫毒素是靶 向性治疗肿瘤的代表性药物，也是当前免疫学研究的热点之一，被称为
3、“生物导 弹”。近年来，利用基因工程技术构建了许多不同用途的免疫毒素。免疫毒素是 具有导向能力的分子( 载体) 和具有细胞毒性的分子( 毒素) 构成的具有特异性细胞 杀伤能力的杂合分子。载体一般由抗体、细胞因子和激素等组成，毒素一般为 来自于细菌或植物。载体可以把毒素定向带到病灶部位，将癌细胞或病变细胞 杀死，减少了对正常细胞的杀伤。研究表明，免疫毒素在体内具有靶向性，使 毒素更易于与肿瘤细胞结合，大大提高了毒素对肿瘤细胞的杀伤率，降低了其 中文摘要 对正常细胞的毒副作用。 人表皮生长因子( h u m a ne p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，E
4、 G F ) 是一种通过 受体起作用刺激细胞增殖和分化的重要生长因子，很多肿瘤尤其是实体瘤细胞 表面有异常高水平的E G F 受体表达；天花粉蛋白( T r i c h o s a n t h i n ，T C S ) 是一 种自然存在的植物单链毒素，具有抑制肿瘤生长的作用。K D E L 是一段高疏水的 序列，它曾应用于P E 毒素的C 末端可以显著的提高P E 杀伤肿瘤细胞的活性。本研 究旨在利用E G F 的靶向性和T C S 蛋白的细胞毒性，将K D E L 序列应用于T C S 的C 末端以提高T C S 的活性，在分子水平设计合成一个融合蛋白，使其具有组成部分 各自的生物学功能，即
5、能够靶向性杀伤肿瘤细胞，有利于临床肿瘤的治疗。 首先使用P C R 方法扩增E G F - L i n k e r - T C S K D E L 基因片段，双酶切后插入表 达载体P e t 2 8 a 中，表达了E G F L i n k e r T C S K D E L 融合蛋白，使用亲合层析纯化 了E G F L i n k e r T C S K D E L 融合蛋白。接下来，我们研究评估了E G F L i n k e r T C S K D E L 的生物活性，并进一步探索了其抑制肿瘤细胞生长的作用机制。 1 首先，我们检测了E G F - L i n k e r T C S K
6、 D E L 对各种肿瘤细胞和正常细胞 的抗增殖作用。选择对数生长期的细胞，( 4 “ - - 5 ) X1 0 5 I l l L 的悬液细胞用0 2 5 的胰蛋白酶消化后用含1 0 小牛血清的培养液配成单细胞溶液，细胞直接以 4 X1 0 4 m l 接种于9 6 孔板1 0 0 U 1 孔；细胞贴壁后，添加含不同浓度目的蛋白的同 样培养基l O O p l 孔，对照组( O n g m l 融合蛋白) 1 2 个平行孔，融合蛋白每个剂 量组设6 个平行孔，继续培养4 8 h 。吸弃培养基，加含M T T0 5 m g m l 的P B S ( P H 6 8 ) l O O p l 孔，
7、培养4 h 后，快速翻板法除去P B S ， 加二甲基亚砜l O O p l 孑L ，微量振 荡仪振荡5 m i n ，用酶标仪5 7 0 n m 测定各孔吸光度值( o D 值) 。 细胞种板、融合蛋白的加入同M T T 法。融合蛋白加入后4 8 h ，加B r d U 标记 溶液2 0 B l 孔，继续培养1 8 h 。吸弃标记培养基，加固定溶液2 0 0 8 1 孔，室温孵 育3 0 m i n 。快速翻板法除去固定溶液，并将培养板倒扣于滤纸上吸干残余固定液 后，加抗B r d U - P O D 工作溶液室温孵育9 0 m i n 。吸弃抗体偶联溶液，用清洗溶液 2 0 0 B l 孔
8、3 洗板后，加底物溶液l O O p l 孔，室温孵育l O m i n ，加1 MH 龇2 5 u l 孔阻止反应，微板读数仪4 5 0 h m 测吸光度值( A 值) 。细胞生长抑制率按下列公 l l 博士学位论文 式计算： 生长抑制率= ( ( 正常对照组A 值一用药组A 值) 正常对照组A 值) X1 0 0 结果表明：E G F L i n k e r - T C S K D E L 对肿瘤细胞和正常细胞都具有一定的生长抑 制作用，但对肿瘤细胞的抑制作用要远远大于对正常细胞的生长抑制作用。M T T 法检测其对人肺腺癌A 5 4 9 ，人肝癌H e p G 2 和人正常肝L 0 2
9、细胞的I C 5 0 分别为 2 5 3 肛g m l 、5 5 6 1 , g m l 和大于1 0 0 肛g m l 。 2 接着，我们应用流式细胞仪研究检澳 E G F L i n k e r - T C S K D E L 是否可以诱 导肿瘤细胞的凋亡。 培养细胞、分组。然后加入药物作用3 小时后收集细胞。收集各组细胞于离 心管中，离心后用冰冷的P B S 洗细胞2 次弃去上清液；将细胞沉淀重悬于7 0 乙 醇( 用P B S 稀释) 5 0 0 p1 的P B S 中，固定细胞3 0 m i n 以上。离心后，弃上清。留下 约5 0 pl 细胞悬液加1 0 I l1 的R N a s
10、 e 即R N A 酶( 1 0 m g m 1 ) 。3 7 水浴3 0 m i n 。2 n P B S 约3 0 0l a1 后加入碘化丙啶( 终浓度2 0ug m 1 ) 染色，室温下避光1 5m i n ，2 0 0 目 滤网过滤后，研究结果表明，E G F L i n k e r T C S K D E L ( 0 5 ，1 ，2 ，4 p g m 1 ) 作用肿 瘤细胞3 4 , 时具有诱导A 5 4 9 细胞凋亡的作用，凋亡率分别为：6 9 、1 1 7 、2 2 1 ， 3 9 8 ；融合蛋白能明显抑制细胞S 期的合成，流式细胞仪检测将肿瘤细胞增殖 阻滞在D N A 合成的S
11、 期 3 随后我们进行了整体动物抗肿瘤实验。E G F - L i n k e r - T C S K D E L 对小鼠的半 数致死剂量( L D 轴) 为：雄性7 3 4 5 2 肛g k g ，雌性7 3 3 3 1p g k g 。肿瘤接种： 常规培养A 5 4 9 肺癌细胞，用生理盐水稀释为5 1 0 6 个m l ，以0 2 m l 只接种于 小鼠右侧腋窝皮下。分组与给药：将接种肿瘤后的小鼠按体重分为5 组，每组5 只。肿瘤对照组：尾静脉注射生理盐水；融合蛋白高剂量组：尾静脉注射 1 0 0 p g k g d ；融合蛋白中剂量组：尾静脉注射5 0 I _ t g k g d ；融
12、合蛋白低剂 量组：尾静脉注射2 5 9 9 k g d ；环磷酰胺组：腹腔注射环磷酰胺l O O m g k g d ； 各组均于肿瘤接种后次日开始给药，注射容积为0 1 m l l O g ，每日1 次，连续 1 4 d ，阳性对照药环磷酰胺隔日腹腔注射一次。全程给药结束后次日，处死动物， 称取鼠重、瘤重，肿瘤组织随后用1 0 的甲醛溶液固定常规脱水、透明、浸蜡并 I I I 中文摘要 制成石蜡切片，供免疫组化实验用。按下列公式计算抑瘤率。 抑瘤率= ( ( 正常对照组瘤重均值一用药组瘤重均值) 正常对照组瘤重均值1 0 0 抑瘤率 4 0 ，P 10 0 I _ t g m lf o r
13、h u m a nA 5 4 9l u n ga d e n o c a r c i n o m a ，h u m a nh e p a t o m aH e p G 2a n dL O 一2n o r m a ll i v e r c e l l s r e s p e c t i v e l yd e t e c t e db yM T T m e t h o d 2 S e c o n d l y ，w et r i e dt of i n dw h e t h e rE G F L i n k e r - T C S K D E Lc o u l di n d u c et h e a
14、 p o p t o s i so f t u m o rc e l l su s i n gf l o wc y t o m e t r ye q u i p m e n t A f t e rc u l t i v a t i n ga n dg r o u p i n gc e l l s ，w ea d d e dd r u g sa n dc o l l e c t e dc e l l sa f t e r 3 hc u l t i v a t i o n T h ec e l l sw e r ec o l l e c t e di nc e n t r i f u g et u
15、 b ea n dc e n t r i f u g e d T h ec e l l A B S l R A ( 了r p r e c i p i t a t i o nw a sw a s h e db yc o l dP B S t w i c ea n dt h es u p e m a t a n tw a sd i s p o s e do f T o f o s s i l i z ef o rm o r et h a n3 0 m i n ，w ep u tc e l l si n5 0 0 I - t l7 0 e t h a n o ls o l u t i o n ( d
16、 i l u t e d b yP B S ) 5 0 I t lc e l ls u s p e n s i o n c o u l db eo b t a i n e da f t e rc e n t r i f u g i n ga n d10 p lR N a s e ( R N Ae n z y m e ，1 0 m g m 1 ) w a sa d d e d A f t e r3 0 m i ni n3 7 “ 1 2 ，w ea d d e dI o d i z a t i o n a z i r i d i n e ( f i n a lc o n c e n t r a t i o n2 0p g m i ) f o rd y e i n g W ef i l t r a t e dt h er e s u l t i n gs o l u t i o n
