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1、目 录 基因诊断与基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy 目 录 目 录 一、基因诊诊断的概念、特点及临临床意 义义 定义： 利用分子生物学技术，通过检测基因及基 因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断 的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、 RNA，也可以是蛋白质或者多肽。 目 录目 录 诊断依据(遗传物质改变) lDNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及 其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平 从低到高； l基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色 体转位引起基因异常激活或灭活。 目 录目 录 基因诊断的特点 高特异性 高灵敏性 早期诊断性 应用
2、广泛性 目 录 目 录 二、基因诊断中常用的分子生物学技术 n核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） n聚合酶链式反应(PCR) n单链构象多态性（SSCP） n限制性片段长度多态性（RFLP） nDNA序列测定（DNA sequencing） n生物芯片（biochips） nWestern免疫印迹（Western blotting） n免疫组织化学诊断 目 录 目 录 单链构象多态性分析 （single-strand conformation polymorphism, SSCP） DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不 同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶
3、中的 构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的 差别可使各种序列不同的单链分离开来。 目 录目 录 PCR-SSCP分析原理示意 目 录目 录 正常人纯合突变杂合突变 + PCR-SSCP分析 目 录 目 录 限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切 位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同 长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。 目 录 目 录 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某 一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩 增后用该限制酶
4、切割PCR产物，根据电泳后酶 切片段长度变化，即可作出诊断。 PCR-RFLP 目 录 目 录 ABCDEFG D E F B G C A GAATTC CTTAAG E F B G C +D A EcoR 限制性内切酶位点的变化 目 录 目 录 DNA序列测定 (双脱氧末端终止法) 目 录目 录 左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究 目 录 目 录 基因芯片杂交流程示意图 目 录 目 录 基因诊断中常用的分子生物学方法比较 方法优点与问题解决方案 核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐选择合适的探针 PCR灵敏度、特异性高设计合适的引物 SSCP操作简便、检出率不高选择合适的片段 RFLP
5、结果可靠但限制较多选择合适的限制酶 DNA测序可自动化，但不适宜广泛使用与PCR配合使用 生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛 使用 选择合适的芯片 目 录 目 录 基因诊断技术路线与方法 n直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表 达是否异常 n间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因 进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决 定基因诊断的技术途径选择。 目 录 目 录 （一）直接诊断途径 必要条件： 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变 化）已知 目 录 目 录 5/ 5/ 3/ 3/ RFLP 1.点突变的检测
6、 （1）有限制性内切酶位点改变 目 录目 录 斑点杂交、反向斑点杂交 AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、 PCR产物直接测序 5/ 5/ 3/ 3/ （2）无限制性酶切位点改变 目 录目 录 在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。 包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替 换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包 括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合 征）等。 2. 基因重排的检测 核酸分子探针杂交与PCR 目 录目 录 BamHI BamHI 21 2 10 kb 14 kb probe -珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断 -珠蛋白基因不同程度的缺失可引起 不同
7、类型的-珠蛋白生成障碍性贫血 目 录 目 录 根据引物3端的互补与否，设计一对与正 常或突变模板配对的特异引物 等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR） 目 录目 录 3. 基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析 mRNA长度分析 目 录 目 录 （二）间接诊断途径 1.采用原因 致病基因未知或基因结构不确定 致病突变机制不清 致病位点不便检测 目 录目 录 DNA多态性：指群体中的DNA分子存 在至少两种不同的类型，即个体间同一染色 体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异 或变异。 多在进化中形成，本身并不致病，只是 与某些遗传性
8、致病基因有一定连锁关系。 2. 遗传标记 目 录目 录 间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记 三代遗传标记： RFLP（基于核酸分子杂交技术） VNTR (variable number of tandem repeats) ; STR (short tandem repeats) SNP(single nucleotide polymorphism) 目 录目 录 7.6kb 13kb 患 者 正 常 HBS的间接基因诊断 RFLP标记的连锁分析 Hap 7.6kb 13kb Southern印迹杂交 N H P N：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针 目 录 目 录 遗
9、传病的基因诊断 Gene Diagnosis of Hereditary Diseases 目 录 目 录 一、血红蛋白病（hemoglobinopathy） （一）镰状细胞贫血病 （二）-珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病（Hemophilia） 甲型血友病基因诊断 三、脆性X综合征 目 录 目 录 （一）镰状细胞贫血病 一、血红蛋白病 1.镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法 2.HBS的限制性内切酶谱分析 3.HBS的PCR-RFLP分析 目 录 目 录 n正常的（N）的ASO探针： 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 n突变的（M）的ASO探针： 5-ACT
10、 CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3 1.镰状红细胞贫血患者基因诊断 ASO杂交法 目 录 目 录 斑点杂交结果 N：正常；M突变 镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测 N-ASO M-ASO 正常 突变 突变 纯合子 杂合子 纯合子 53 正常基因 1.15kb (CCT GAG G) 53 突变基因 1.35kb (CCT GTG G) 镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析 Mst酶切位点（CCTNAGG） 2. HBS的限制性内切酶谱分析 目 录 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人突变携带者 患者 镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析 目 录 目 录目 录 3.
11、HBS的PCR-RFLP分析 正常人的扩增产物经 Mst 消化可生成54bp和56bp两个片段，而镰状细 胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110bp，杂合子可见三条带 正常人杂合体患者 Marker 目 录 目 录 1. PCR-RFLP分析 -珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测 M：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段； 2：bA/ bA； 3：bA/ bT； 4：bT/ bT 注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量标准中低于200 bp的片段太小，在0.8的琼脂糖凝胶中不易被观察到 （二）-珠蛋白生成障碍性贫血症 目 录目 录 -珠蛋白生成障
12、碍性贫血症的反向斑点杂交分析 2. 反向斑点杂交 目 录 目 录 二、血友病（Hemophilia） n甲型血友病是由于血浆凝血因子VIII（ FVIII）缺陷造成。 n甲型血友病的基因突变类型已有300余种， 其中点突变占174种；另有部分患者是由于 缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致 。 目 录 目 录 1. FVIII基因倒位的DNA印迹分析 将基因组DNA用Nco I，Dra I或Bcl I等内切酶 （酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行 杂交分析，正常人表现为21.5 kb、14 kb和16 kb三种 类型。I型倒位患者表现为20、17.5和14 kb三种类型 ；型倒位
13、患者表现为20、16和15.5 kb三种带型。 在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现 。 目 录 目 录 2. FVIII基因突变的检测 （1）依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记 的连锁分析 （2）RFLP连锁分析 （3）VNTR分析 （4）短串联重复序列（STR）的连锁分析 目 录 目 录 三、脆性X综合征 n脆性 X 智力低下基因1（FMR1）5非翻译区遗传不稳 定的(CGG)n 三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻 CpG 岛的异常甲基化。 n正常人中约为 850 拷贝。 n男性和女性携带者增多到52200拷贝，相邻的CpG 岛 未被甲基化，称为前突变（premutatio
14、n）。 n男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到2001000 拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变（full mutation）。 n全突变可关闭相邻FMR1基因的表达，FMR1 mRNA在 几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状 。 目 录 目 录 脆性X综合征常用基因诊断方法 1PCR-ASO 2DNA连锁分析 3Souhern印迹杂交法 4PCR扩增 感染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases 目 录 一、病毒性疾病 n甲型肝炎病毒（HAV） HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技术可从粪便 中检测出甲型肝炎病毒的基因组
15、RNA。 n乙型肝炎病毒（HBV） 设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNA片 段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNA ，以便分型。 n丙型肝炎病毒（HCV） HCV为正链RNA病毒，先反转录成cDNA，再 进行巢式PCR检测HCV。 目 录 目 录 目 录 二、细菌引起的疾病 n结核分枝杆菌 先设计一对特异性引物，用PCR 技术扩增出一383 bp序列，再用探针 杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。 n幽门螺杆菌（HP） 主要采用PCR技术：检测HP染 色体DNA特异片段；检测HP尿素酶 A基因；用PCR-RFLP鉴别HP菌株 。 目 录 目 录 三、寄生虫及衣原体感染 n疟原
16、虫 n卡氏肺孢子虫 n衣原体感染 诊断方法：核酸杂交和PCR技术 目 录 目 录 肿瘤的基因诊断 Gene Diagnosis of Malignant Tumors 目 录 目 录 一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌 结肠癌 目 录 目 录 一、原癌基因与抑癌基因的检测 1原癌基因的检测 ras 基因家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。最常见 的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。 胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主，如第12 位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为TGT、 GTT或GAT，少数突变为GCT。 急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N -ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。 目 录 目 录 PCR 及PCR-SSCP分析：扩增ras 基因第 12位密码子点突变部位，再用SS
