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1、壳聚糖对肉仔鸡外周血 T淋巴细胞亚群的影响 金晓史彬林李慧英方丽惠张彩芬郭晓宇陈志刚 金晓,内蒙古农业大学动物科学与医学学院,0 1 0 0 1 8, 呼 和浩特市赛罕区昭乌达路3 0 6号。 史彬林 (通讯作者) 、 李慧英、 方丽惠、 张彩芬、 郭晓宇, 单 位及通讯地址同第一作者。 陈志刚, 内蒙古自治区赤峰市松山区家畜改良站。 收稿日期:2 0 0 7 - 1 1 - 2 7 国家自然科学基金项目 (3 0 6 6 0 1 3 0) 壳聚糖学名为( 1 , 4 ) - 2 -氨基- 2 -脱氧- - D葡萄糖, 是甲壳素脱乙酰基的产物,属于天然来源的碱性多糖。 已有研究表明,壳聚糖及其
2、衍生物作为饲料添加剂能 改善动物生产性能,增强机体免疫能力,且具有无残留、 不易产生耐药性等优点,是近年来动物营养学研究的热 点之一。尽管壳聚糖不能为动物消化吸收( G a l l a h e r等, 2 0 0 0 ) 1 ,但一些研究结果表明 2 - 4 ,口服壳聚糖可增强机 体的细胞免疫功能和体液免疫功能。石明建等( 1 9 9 9 ) 5 和陈海燕等( 2 0 0 7 ) 6 报道,壳聚糖可活化T淋巴细胞,加 速T细胞的成熟和分化,促进T淋巴细胞释放免疫因 子,激发机体细胞免疫应答,从而提高机体全身免疫应 答水平。朱立贤等( 2 0 0 3 ) 7 和史彬林等( 2 0 0 5 ) 8
3、 研究了日 粮中添加不同水平壳聚糖对肉仔鸡免疫指标的影响, 结果发现,壳聚糖能增强肉仔鸡的免疫机能,并且存在 剂量依赖关系。目前关于壳聚糖对家禽免疫功能影响 的研究虽有一些报道,但在机理研究方面不够深入,尤 其在壳聚糖对肉仔鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响方 面尚未见报道。本试验在前人研究的基础上,探讨了壳 聚糖对肉仔鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响,旨在为 揭示壳聚糖对肉仔鸡的免疫作用机理提供参考。 1材料与方法 1 . 1试验动物及试验设计 选取1日龄A A健康雄性肉仔鸡2 4 0只, 采用完 全随机设计方法分为6个日粮处理, 每个处理5个重 复, 每个重复8只鸡, 进行为期6周的饲养试验。6种
4、试验日粮是分别在基础日粮中添加0、5 0、2 0 0、5 0 0、 10 0 0和20 0 0m g / k g的壳聚糖配制而成, 试验所用壳 聚糖购于山东济南海德贝海洋生物工程有限公司, 脱 乙酰度为9 0 . 5 2 %。 1 . 2基础日粮及饲养管理 试验日粮为玉米豆粕型日粮, 基础日粮组成及 营养水平见表1。 表1基础日粮组成及营养水平(风干基础) 组成( %) 玉米 豆粕 豆油 石粉 磷酸氢钙 食盐 蛋氨酸 赖氨酸 微量元素预混剂 维生素预混剂 合计 营养水平 代谢能(M J / k g) 粗蛋白( %) 钙( %) 总磷( %) 赖氨酸( %) 蛋氨酸( %) 1 2 1d 5 2
5、 . 6 9 4 0 . 0 0 3 . 0 0 1 . 1 0 1 . 9 0 0 . 3 7 0 . 1 9 0 . 0 5 0 . 5 0 0 . 2 0 1 0 0 . 0 0 1 2 . 7 1 2 1 . 3 7 1 . 0 8 0 . 6 2 1 . 2 5 0 . 5 4 2 1 4 2d 5 8 . 9 8 3 3 . 8 0 3 . 0 0 1 . 8 0 1 . 2 5 0 . 3 7 0 . 0 7 0 . 0 3 0 . 5 0 0 . 2 0 1 0 0 . 0 0 1 2 . 7 8 1 8 . 9 9 1 . 0 3 0 . 5 5 1 . 1 0 0 . 3
6、9 生长阶段 项目 注: 每千克基础日粮中添加F e 8 0 m g、Z n 8 0 m g、M n 8 0 m g、C u 8 m g、I 0 . 3 5m g、S e0 . 1 5m g、V A30 0 0I U、V D12 5 0I U、V E1 5I U、V K 2 . 2m g、V B11 . 5m g、V B28 . 0m g、V B62 . 5m g、V B1 20 . 0 1 1m g、烟酸 4 4m g、 泛酸1 1m g、 叶酸0 . 9m g、 生物素0 . 1 1m g、 胆碱5 5 0m g。 试验前对鸡舍、 用具进行消毒处理。试验鸡采用 肉鸡笼单层笼养, 每一处理的
7、5个重复组在鸡舍内分 开布局, 以减少环境因素的影响。鸡笼均采用红外线 加热装置自动控温, 在前3d舍内温度保持3 3, 之 后每周降低3, 直至降到2 1后保持恒定不变。试 验前期保持2 3h / d、 后期1 4h / d光照, 并采用机械通 风方式进行通风换气, 每天人工清粪1次。试验鸡自 由采食、 自由饮水, 按常规免疫程序进行免疫。 1 . 3测定指标及方法 分别在2 8、4 2日龄时,于各处理的每重复组随机 抽取1只鸡,从翅静脉采集抗凝血。取1m l血样于试 管中,加入磷酸缓冲液( P B S ) 1m l ,充分混匀,在盛有2m l 淋巴细胞分离液的试管中沿管壁缓缓加入上述混合
8、液, 然后以20 0 0r / m i n离心2 5m i n, 用一次性吸管吸 取乳白色淋巴细胞层到预冷的离心管中, 置于冰浴盒 中, 加适量P B S( 1 2m l ), 混匀,4下以20 0 0r / m i n 离心1 5m i n, 倾弃上清液, 再加适量P B S, 重复上述步 骤。 倾弃上清液后, 加入P B S5 0 0 l, 混匀, 分装2 0 0 l 混悬液2份,分别加入适量C D 4 + 、C D 8 + 及C D 3 + 单抗, 混匀,在4下避光孵育3 0m i n后,加适量P B S混 匀, 4下以15 0 0r / m i n离心5m i n,弃掉上清液, 再 加
9、适量P B S后,用流式细胞仪测定C D 3 + 、C D 4 + 、C D 8 + 饲料工业 2 0 0 8年第2 9卷第6期 饲 养 试 验 4 1 值, 并计算C D 4 + / C D 8 + 比值。 1 . 4数据处理 试验数据利用S A S统计软件的回归分析程序进 行统计分析。 2结果与分析(见表2 ) 从表2可见,2 8和4 2日龄时各壳聚糖添加组肉 仔鸡血液中C D 3 + 、C D 4 + 及C D 8 + 含量测定值大多数高 于对照组,其中添加量为10 0 0m g / k g时3种T淋巴 细胞亚群的含量均表现出较高水平。 但从回归分析结 果看, 在2 8日龄时, 仅有C
10、D 8 +含量随壳聚糖添加量 的增加呈显著的二次曲线上升变化( P = 0 . 0 3 6 ), 而C D 3 + 和C D 4 +则未出现明显的剂量依赖关系;在 4 2日龄 时,C D 3 +呈现较明显的一次线性( P = 0 . 0 5 1) 或二次曲 线(P = 0 . 0 7 4) 上升趋势,C D 4 + 也呈显著的一次线性( P = 0 . 0 1 0 )或二次曲线( P = 0 . 0 3 8 )升高, 而C D 8 +则未出现明 显的剂量依赖关系。 表2壳聚糖对肉仔鸡外周血C D 3 +、 C D 4 +、 C D 8 +及 C D 4 + / C D 8 +的影响 一次线性
11、0 . 8 7 3 0 . 0 5 1 0 . 9 6 8 0 . 0 1 0 0 . 5 4 4 0 . 9 3 9 0 . 1 2 6 0 . 0 1 0 二次曲线 0 . 9 8 6 0 . 0 7 4 0 . 5 8 9 0 . 0 3 8 0 . 0 3 6 0 . 1 9 5 0 . 0 6 9 0 . 0 0 8 0 2 8 . 2 2 2 5 . 3 7 1 6 . 0 7 1 7 . 0 4 1 7 . 3 1 1 5 . 1 9 0 . 9 3 1 . 1 9 5 0 0 2 2 . 8 0 3 2 . 4 6 1 7 . 7 8 2 1 . 4 6 1 9 . 7 1 1
12、 8 . 6 0 0 . 9 3 1 . 2 4 10 0 0 3 1 . 9 8 3 7 . 0 5 2 3 . 1 6 2 3 . 1 4 2 3 . 5 1 2 0 . 5 8 0 . 9 6 1 . 1 4 5 0 3 1 . 0 5 3 2 . 3 2 2 1 . 0 7 2 1 . 2 2 1 6 . 2 2 1 7 . 4 8 1 . 3 4 1 . 2 9 2 0 0 2 8 . 7 2 2 7 . 0 2 1 8 . 0 7 1 8 . 1 6 1 7 . 2 6 1 7 . 1 0 1 . 0 9 1 . 0 8 20 0 0 2 7 . 4 7 3 5 . 2 8 1 7
13、 . 2 3 2 6 . 6 8 1 3 . 1 4 1 5 . 8 0 1 . 5 5 1 . 7 8 2 8 4 2 2 8 4 2 2 8 4 2 2 8 4 2 日龄(d) C D 3 +( %) C D 4 +( %) C D 8 +( %) C D 4 +/ C D 8+ 项目 4 . 4 6 3 . 5 4 3 . 7 1 1 . 6 6 2 . 8 0 2 . 3 0 0 . 2 0 0 . 1 6 S E M 壳聚糖水平(m g / k g)P值 此外, C D 4 + / C D 8 + 比值不论在2 8或4 2日龄时均以 2 0 0 0 m g / k g处理组最高。从回
14、归分析结果看, C D 4 + / C D 8 + 比值在2 8日龄时呈现一定的一次线性( P = 0 . 1 2 6 )或二 次曲线(P = 0 . 0 6 9) 升高趋势, 而在4 2日龄时则呈极显 著的一次线性(P = 0 . 0 1 0) 或二次曲线( P = 0 . 0 0 8 )剂量依 赖关系。 3讨论 T淋巴细胞亚群的稳定是维持机体正常免疫调 节功能所必需的, 是评估机体细胞免疫功能的重要指 标。C D 3 + 抗体检测T淋巴细胞总数;C D 4 + 是辅助/诱导 细胞( T h / T i )的标志, 具有辅助T细胞转变为效应T细 胞、B细胞生成抗体和巨噬细胞活化等功能;C D
15、 8 +是 抑制性T细胞( T s )的标志, 维持机体内环境的稳定。 C D 4 + 和C D 8 + 细胞是机体免疫调节的枢纽,C D 4 + / C D 8 + 值较高时, 表明机体处于较好的免疫状态, 而当C D 4 + / C D 8 + 失调或缺陷时, 可导致各种免疫疾病发生 9 。 目前, 关于壳聚糖对肉仔鸡外周血T淋巴细胞亚 群影响的研究尚未见报道, 然而在其它动物上的研究 已有少量报道。应自忠( 2 0 0 0 ) 1 0 对小鼠的研究发现, 壳 聚糖能使小鼠外周血液中淋巴细胞总数和T淋巴细 胞阳性率明显增高。本试验也得到了相似的研究结 果,添加壳聚糖使肉仔鸡血液中C D 3
16、 + 、C D 4 + 、C D 8 + 及 C D 4 + / C D 8 + 值有所增加,并随添加剂量增加呈一次线 性或二次曲线上升趋势,而且在4 2日龄表现出了更 为明显的剂量依赖关系。 这说明日粮中添加一定剂量 的壳聚糖能提高肉仔鸡的细胞免疫水平, 并且随着饲 喂时间的延续, 这种免疫促进作用逐步增强。 4结论 试验结果表明,日粮中添加一定剂量的壳聚糖可使 肉仔鸡T淋巴细胞亚群C D 3 + 、C D 4 + 、C D 8 + 及C D 4 + / C D 8 + 有所增加, 从而提高肉仔鸡的细胞免疫功能。 参考文献 1 G a l l a h e r CM , M u n i o nJ , H e s s l i n kR , e t a l . C h o l e s t e r o l r e d u c t i o n b yg l u c o m a n n a na n dc h i t o s a ni sm e d i a t e db yc h a n g
