蛋白质的分离纯化解读

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1、 第一节 引言 n蛋白质存在于一切生物体中，是非常重要的 生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者， 担负着生物催化、物质运输、运动、防御、 调控及记忆、识别等多种生理功能。 第二章 蛋白质分离纯化原理与技术 一、分离纯化的意义 从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与 功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现 象的本质有重大意义。 工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等 工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉 酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。 医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 基因工程的需要 二、分离纯化的要求 1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作 为研究蛋白和一级结

2、构、空间结构，一级结构与功能 的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析 的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和 蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物 活性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有 不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。 三、分离纯化的一般程序 蛋白质分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段： 材料的选择和预处理 破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离） 分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离 其中前两个阶段为分离纯化的前处理。 第二节 蛋白质分离纯化的前处理 一、材料的选择与预处理 n选择材料主

3、要根据实验目的而定。工业生产上注意选 择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本 低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考 虑上述问题，只要能达到实验目的即可。 n实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料 需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植 物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。 另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。 若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。 二、细胞的破碎 n分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分 子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出 来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性。 因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但 若材料是体

4、液（如血）或生物体分泌到体外的 分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。 n组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模， 不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法 和条件也不同。 v一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎 或用超声波处理破碎。 v植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶 等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的 提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能 达到目的。 v细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的 骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大 分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与 石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚 糖）。 三、细胞器的分

5、离 n细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细 胞还有叶绿体。 n如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为 了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染， 还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某 一物质。 n细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞 在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇 、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不 同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位 ，经多次分步离心后，即可获得所需组分。 四、提取 n组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细 胞内含物被释放出来，必须立即将其置于 一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解

6、 ，并尽可能保持原来的天然状态，避免因 长久放置造成制备物的分解破坏，这就是 提取。 1、蛋白质的提取 n大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸 溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为 主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20 -50m mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）或 0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提 取液。 n对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性 较多的蛋白质，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸 ，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇 、丙酮、异丙醇、正丁醇等。 第三节 蛋白质分离纯化 n从细胞中提取得到的蛋白质往往是不纯的 ，含有大量

7、杂质，必须进一步分离纯化， 这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离 两步进行。 一、蛋白质的分离纯化 n蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异 性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。 性质 方法 v分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 v 溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀 v电荷 电泳、离子交换层析 v吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析 ） v对配体分子 亲和层析 的生物亲和力 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶 剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量 的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、 处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩 蛋白质，但分辨率

8、低。 1、粗分级分离 （1）盐析 l 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NH4)2SO4，Na2SO4， 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。 l 盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用， 使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离 子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作 用，破坏蛋白质分子表面的水化层，使蛋白聚集沉淀。同 时盐离子可以中和蛋白质的表面电荷，也促进蛋白的沉淀 。 l 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极 性基团的种类、数目以及排布的不同，其水 化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不 一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使 不同的蛋白质分别

9、沉淀。如： 血清 球蛋白 清蛋白 (NH4)2SO4 50%饱和度 100%饱和 析出 析出 分段盐析 （2）等电点沉淀 n蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数 量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等 于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。 n不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节 溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与 其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。 （3）有机溶剂法 n与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮 等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。 n有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个： v降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离 基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促

10、进 了蛋白质分子的聚集沉淀。 v是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋 白质分子沉淀。 n室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀， 而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然 后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中， 防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上 解决变性问题。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀 需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓 度的有机溶剂分离不同的蛋白质。 2、细分级分离 n一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂 质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分 辨率的柱层析及电泳方法。 n常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层 析、疏水吸附层析、亲和层析。 n常用

11、的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电 聚焦电泳。 n另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一， 制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。 酶的活力测定 n在酶的制备过程中，每一步骤都应测定留用以及 准备弃去部分中所含酶的总活力和比活力，以了 解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而 决定这一步的取舍。 n总活力=活力单位/ml酶液总体积（ml） n比活力=总活力单位数/总蛋白（氮）mg n纯化倍数=每次比活力/第一次比活力 n回收率（产率）=（每次总活力/第一次总活力） 100% 第四节 蛋白质纯度鉴定 n生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度 。 n蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方

12、法有：SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉 降分析法、免疫化学法、N-末端氨基酸分析法等。 v纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度 移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质 在离心场中，应以单一的沉降速度移动。 v选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的 纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。 第五节 蛋白质的层析分离 n应用广泛。特征：有一个固定相和一个流动相 。由于待分离的各种物质在这两个相分配系数 不同，当两个相作相对运动时，这些物质在两 相间反复多次分配，结果使其相互分开。 n根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和 液相层析；按层析

13、原理可分为：吸附层析、分 配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和 层析等。按操作形式分为：柱层析、薄层层析 、纸层析等。 n 分配系数: k=Cs/Cm ,物质在固定相与流动相浓度之 比。质量分配系数：D=kVs / Vm , Vs , Vm 为固定相 和流动相的体积。 一、层析的一般原理 3216 16 8 8 168 12 4 12 4 12 2 2 8 如果柱顶加入32mg样品，样 品的质量分配系数D为1，即样品 在两相中是等量分配。经过5层的 平衡分配后，样品在柱的分配情 况见图。样品集中在中间。如果 D1，样品集中在中间偏下。 离子交换层析(IEX)是根据电荷来分离分子的。 离子交

14、换剂是通过化学反应将解离基团引入到惰性支持物 上形成的。分为： 阳离子交换剂: 解离基团带负电, 结合阳离子; 阴离子交换剂: 解离基团带正电, 结合阴离。 蛋白质分子是两性物质。当pHpI，分子带负电，可结合 阴离子交换剂；当pHpI，分子带正电，可结合阳离子交换剂。 如阳离子交换剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡： 二、离子交换层析 （一）基本原理 带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。 由于 pH可改变蛋白质的带电性质和带电量，盐离子会影响蛋 白质在交换剂上吸附。所以用一定浓度的盐溶液或一定 pH 的缓冲液就可把蛋白质从离子交换剂上洗脱下来。 对多组分混合物，每种分子所带的电荷不同，因此

15、，可 用不同的离子强度 或不同的pH溶液将蛋白质从交换剂 上一一洗脱下来。 （二）离子交换剂的基本类型 根据可供交换的离子的性质，离子交换剂可被分为 阳离子交换剂和阴离子交换剂。若按酸碱性的强弱，又 可分为强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂 。 强酸和强碱型交换剂能在较广泛的pH范围内（pH2 12）完全解离。弱酸型交换剂在低于pH4、弱碱型 交换剂在高于pH9就难于解离，因而失去交换能力。因 为一般蛋白质在pH68之间稳定，所以常用弱酸或弱 碱型交换剂。 离子交换基团的结构和性质 类型名称结构式性质 DEAE 二乙基氨基乙基 (diethylaminoethyl) -O-CH2-CH

16、2-N+- (C2H5)2 弱碱性 QAE 季胺乙基 (quaternary aminoethyl) -O-CH2-CH2-N+- (C2H5)3 强碱性 Q 季胺 (quaternary amine) -CH2-N+-(CH3)3 强碱性 CM 羧甲基 (carboxymehyl) -O-CH2-COO -弱酸性 SE 磺乙基 (sulfoethyl) -O-CH2CH2-SO3-强酸性 SP 磺丙基 (sulfopropyl) -O-CH2-CH2-CH2-SO3-强酸性 P 磷酸基 (phosphate) -O-PO3-中酸性 S 磺酸基 (sulfonate) -CH2-SO3-强酸性 可用来作为交换剂支持物的物质种类较多。早期用于分离氨 基酸、小肽和其它小分子物质的离子交换树脂的支持物是聚苯乙 烯类。 分离蛋白质的常用的亲水性支持物。有三大类：纤维素、葡 聚糖凝胶(sephadex)、琼脂糖凝胶(sepharose)和合成凝胶 (Tr