实验细胞器的分分离

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1、细胞器的分级分离 o高等植物叶绿体制备 o动物细胞线粒体的分离 实 验 目 的 o学习分离细胞器的一般原理及方法 实验原理 o 细胞内不同细胞器的比重和大小都不相同 ，在均匀密度介质中不同离心力下沉降的细 胞器组成不同或在梯度介质中离心后分布于 不同密度层，根据这一原理，差速离心法或 密度梯度离心法就可将细胞内各种组分分离 出来。 o分离流程： 破碎组织（匀浆或研磨）差速离心或密度 梯度离心分离细胞器结果检验分析 匀浆（Homogenization） o低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等 渗匀浆介质(即0.25molL蔗糖一 0.003molL氯化钙)进行破碎细胞使之成 为各种细胞器及其包

2、含物的匀浆。 各种匀浆、研磨器 差速离心分级分离(Fractionation) o由低速到高速离心逐渐沉降细胞器。 o先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转 速将上清液中的小颗粒沉淀下来。 o Differential centrifugation High speed Low speed 密度梯度离心（density gradient centrifugation method ） o亦称平衡密度梯度离心法。 o用超速离心机对小分子物质溶液，长时间加 一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从 液面到底部出现一定的密度梯度。 o若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液 内比溶剂密度大的部分就产生大

3、分子沉降， 比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力 和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物 。 Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation 分析 o分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化 方法进行形态和功能鉴定。 （一）实 验材料 o多叶绿菜 实 验试剂 o0.4M蔗糖 o0.35M氯化钠（每升19.856g氯化钠） 实 验用品 1、普通台式离心机：4台 2、研钵：30个 3、40ml小烧杯:30个 4、纱布：5包 5、离心管60支 6、载玻片及盖玻片见指导。 一、叶绿体的分离 细胞中及匀浆中的叶绿体 叶绿体的分离步骤 1、采样、洗涤、去叶脉：

4、最好在晴天上午10时左 右选取生长正常的菠菜叶子（菜心、白菜、豌 豆也可）洗干净，用吸水纸擦干，去柄及粗脉 2、预冷：放入4冰箱预冷1h； 3、研磨匀浆：称2克叶子在玻璃研钵中剪碎，先 加12m1制备液，快速磨成匀浆，然后再加 8m1制备液，磨匀； 4、过滤：把匀浆液倒在6层沙布上过滤入小烧杯 ； 5、离心去完整细胞、细胞核等：上述滤液转入 10ml离心管，平衡后在约500rpm（每分钟的 转速）离心2分钟，上清转入另一离心管； 6、离心收集叶绿体：上清液在2600rpm离心5分 钟，弃上清液，沉淀即是叶绿体。 7、悬浮叶绿体：沉淀中加入制备液适量，用吸管吹 打悬浮、混匀： 8、镜检分离效果 9、叶绿体被膜完整度的测定 ：铁氰化钾光还原的 Hill反应 叶绿体的分离应该注意哪些问题？ 1、选材 2、低温 3、缓冲系统：渗透压、PH、防氧化 4、研磨程度 5、离心速度