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1、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)的检验（一）蜡样芽胞杆菌生物学性状1、形态和染色特性该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端多呈链状排列无荚膜，有周鞭毛。2、培养特性（1）需氧菌，生长温度范围在10-45之间。最适生长温度为28-35。（2）在普通培养基上生长良好。本菌在普通琼脂平板上，生长的菌落呈乳白色，不透明，直径4-6mm边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状。（3）在血液琼脂平板上形成浅灰色、不透明、似毛玻璃状的菌落。菌落周围初呈草绿色溶血时间稍长即完全透明。（4）蜡状芽胞杆菌在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)上的菌落为粉红色(表示不发
2、酵甘露醇)，周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。（5）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常常有菌膜或壁环，振摇易乳化。3、生化性状：（1）葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下35培养24h。培养基应由红色变为黄色。（2）硝酸盐还原试验：阳性（红色）。（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸）（3）V-P试验：接种于改良V-P培养基中，35培养48h。加V-P试剂及肌酸数粒，静止1h，应为阳性反应（伊红色）。（4）L-酪氨酸分解试验：接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35培养48h阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白酶）。阴性时应继续培养72h再观察。（5）溶菌酶试验：用
3、直径2mm接种环取纯菌悬液一环接种于溶菌酶肉汤中，35培养24h。该菌在本培养基（含0.001的溶菌酶）中能生长。如出现阴性反应应继续培养24h。4、致病性蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌外，肠毒素也是重要的致病因素。耐热性肠毒素：10030分钟不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素常在米饭中形成。不耐热肠毒素：是引起腹泻型胃肠炎的病因，能在各种食物中形成。5、抵抗力蜡样芽胞杆菌10020分钟即可被杀死；对酸碱不敏感，pH6-11对本菌基本上不受影响，pH5以下，生长可受到抑制。（二）流行病学特点1、季节性特点：以夏、秋季，尤其是610月为多见。2、食品种类剩饭，特别是大米饭。乳
4、及乳制品、畜禽肉类制品、蔬菜、莱汤、马铃薯、豆芽、甜点心、调味汁、色拉。国内：与淀粉质食品相关多。3、临床症状呕吐型中毒：多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为23小时，最短为30分钟，最长56小时；症状以呕吐，腹痉挛为主，腹泻则少见，一般经过810小时而治愈。腹泻型中毒：由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜伏期在6小时以上，一般为614小时；症状以腹泻，腹痉挛，而呕吐却不常见；病程2436小时。1.蜡样芽孢杆菌检验程序：检样25g(ml)+225ml生理盐水中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验GBT4789.28-2003做成10-1-10-5的
5、稀释液选择性培养基（菌数测定）MYP选择性培养基（分离培养）MYP37，18h-24h菌数计算营养琼脂培养基36112h20h36112h20h生长及菌落观察染色镜检生化试验菌株保存报告（三）检测方法10-110-5的稀释液的制备每个稀释度0.1mL接种于2个MYP培养基3611220h菌落计数3611220h挑取菌落接种肉汤和营养琼脂培养基（分离培养）证实试验报告形态观察染色镜检培养特性生化特性生化分型2菌数测定以无菌操作将检样25g或25ml按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-110-5的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，
6、用L形棒涂布于整个表面，置37培养1220h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵甘露醇）环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从中挑取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。计数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验，根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数，即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。例如将0.1mL10-4样品稀释液涂布于MYP平板上，其可疑菌落为25个，取5个鉴定，
7、证实四个菌落为蜡样芽孢杆菌，则1g（mL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数为：选取具有15-150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板进行计数。计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。25451041021063分离培养将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上，置37培养1220h，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试验。4证实试验（1）形态观察本菌应为G杆菌，宽度在1m或1m以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。（2）培养特性本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐
8、。（3）生化特性本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。(4)生化分型根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P反应、明胶液化的试验，分成不同型别，见表1。表1蜡样芽孢杆菌生化分型型别生化试验柠檬酸盐利用硝酸盐还原淀粉水解V-P反应明胶液化123456789101112131415（4）与类似菌鉴别本菌与其他类似菌的鉴别见表2。5.结果报告报告1g（mL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数量个g(mL)。实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验一、实验目的1学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。2了解蜡样芽
9、孢杆菌形态特征、培养特性和生化特性。v蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰氏阳性杆菌，在自然界分布较广，食品在正常情况下就可能有此菌存在，因而易从各种食品中检出。蜡样芽孢杆菌能发酵麦芽糖、蔗糖和水杨苷，不发酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、山梨醇和侧金盏花醇卵磷脂酶和酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血，能在24h内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条件下能发酵葡萄糖。二、实验原理三、实验方法与步骤1蜡样芽孢杆菌检验程序2菌数测定以无菌操作将检样25g或25ml按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-110-5的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平
10、板上，用L形棒涂布于整个表面，置37培养1220h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵甘露醇）环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从中挑取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上，置37培养1220h，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试验。3分离培养（1）形态观察本菌应为G杆菌，宽度在1m或1m以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。（2）培养特性本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。4证实试验（3）生化特性本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。四、实验结果根据以上实验作出检验报告。五、思考题1如何区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌？2设计蜡样芽孢杆菌计数程序？
