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1、实验九 酪氨酸酶的动力学 1. 学会测定酶反应速度的基本方法。 2.掌握测定米氏常数Km值的原理和方法。 【目的和要求】 【实验原理】 酪氨酸酶催化的反应为： 475nm 常用单位时间内、产物的浓度增加量表示。 一、酶活力测定 酶反应初速度的测定: Time Product Concentration v= dC /dt A =C d : 3600 M-1cm-1 d: 1cm 确定酶反 应时间！ 二、 底物浓度S对酶反应速度： 一级反应 混合级反应 零级反应 Effect of substrate concentration on the initial velocity of an enz
2、yme-catalyzed reaction. Vmax Km v Km值测定: 双倒数作图法 （一）酶反应初速度的测定：-酶反应时间的确定 在比色杯中，按下表依次加入试剂： 【实验方法】 加入酶液后立即混匀，并每隔15秒读取475nm处的吸光值。 L-多巴（mL）1 磷酸缓冲液（mL）1.97 酪氨酸酶（mL）0.03 注：酪氨酸酶 5U/l 绘制产物浓度C-Time 反应曲线，观察酶反应初速度，确定 酶反应时间。一般在30120秒左右。 时时刻（秒）A时时刻（秒）A 0135 15150 30165 45180 60195 75210 90225 105240 120255 各时刻的吸光值
3、记录在下表： （二）米式常数的测定： 在比色杯中，采用已确定的酶反应时间X，分别记录各 管反应开始时A0和X秒钟后的A1。 管号 15mM L多巴 (ml) 磷酸缓缓冲液 （ml） 酪氨酸酶（ml ） 10.22.770.03 20.32.670.03 30.42.570.03 40.52.470.03 50.62.370.03 每管反应体系仍为3ml。 记录数据于下表： 利用双倒数作图法，横坐标为1/S，纵坐标为1/v，分别求出 Vmax和Km。 管号 L多巴浓浓度 （mM） A0A1A（A1- A0） V（mM/min ） 1 2 3 4 5 【思考题】 1. 为什么酶活力测定的是酶反应初速度？如何确 定酶反应时间？ 2. Km值的意义是什么？
