基因功能研究方法

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1、基因功能研研究方法 随着生物学研究在分子水平上的不断深入和推进， 越来越多的新基因得以成功克隆，对新基因功能的研究 显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组学的重 要研究内容。 1.微阵阵列分析 微阵阵列(microarray)是近年来发展起来的可用于大 规模快速检测基因差异异表达达、基因组组表达谱达谱 、DNA 序列多态态性、致病基因或疾病相关关基因的一项研究基 因功能的新技术。它包括cDNA微阵列(cDNA microarray)和DNA芯片。 原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列 标签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核 苷酸片段) 按

2、横行纵列方式有序点样在固相支持物上 。固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为 微阵列 。 固相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成 的微阵列就称为DNA芯片。 微阵阵列法分析过过程: 首先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA 作为 模板,以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转 录合成cDNA； 其次将所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交； 最后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可 以知道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达; 同样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表 达水平低。 芯片的制作: 目前常用的基因芯片制作方法： u接触触点样样法 u喷喷黑法 u原位合成

3、法 接触触点样样法：是将样品直接点在基体上。优优点是仪器结构 简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器，可 以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA；不足是每个样品 都必须合成好、经过纯 化、事先保存的。 喷喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电 晶体或其他推进形 式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样需 要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。 在1cm2面积上可喷射10000个点。 原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸 原位光刻DNA合成技术。 原理：在合成碱基单体的5羟基末端连上一个光敏保护基， 利用光照射使羟基端脱保护，然后

4、逐个将5端保护的核苷酸 单体连接上去，这个过 程反复进行直至合成完毕。 原位合成法的优优点：合成循环中探针数目呈指数增长，在 1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。 2.基因转导转导 技术术 基因转导是将目的基因转入某一细胞中,然后观察该 细胞生物学行为的变化,从而了解该基因的功能。这是 目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法之一 。但因基因的表达受转导效率和是否持续稳定表达两方 面因素的影响。 主要方法有物理的、化学学的和生物的方法。 2.1 物理方法 1. DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但 注入量有限, 能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转 化率很低, 多通过肿

5、瘤局部多点注射给药。 2. 颗颗粒轰击轰击 技术术:将目的基因包被金属以后,利用高压 发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从 而提高肿瘤细胞的转化率。 2.2 化学学方法 1.脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原 性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有 一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一 种有价值的体内基因转移方法。 2.受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受 体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转 移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝 细胞表面的受体结合来实现 目的基因的转移。 优点:靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运

6、到溶 酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间 短暂 ，表达效率低下。利用腺病毒与内吞 小泡相融合而将 其破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。 2.3 生物学学方法 (主要通过构过构 建病毒载载体来来完成)： 病毒表达载达载 体:以病毒为载体介导的基因转移技术。 u因其转转染效率高、目的基因可稳稳定表达达等优势优势 被 广泛应应用。 1.逆转录转录 病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基 因容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋 白表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低 ，且其随机整合有引起“插入性突变”的可能。 2.腺病毒(adenovirus, Adv

7、): 为近年肝细胞肝癌基因治 疗中报告最多的一种病毒载体。装载外源基因容量最 大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入突 变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引起 宿主免疫反应而使转染效率下降。 3.反义义技术术 反义技术是根据碱基互补原理,利用人工或生物合成的 特异互补的DNA或RNA片段(或其修饰产物)来抑制或封闭 目的基因的表达。 包括: u反义义寡核苷苷酸技术术(Antisense oligonuclerotides , ASON) u反义义RNA技术术 u核酶(Ribozyme)技术术。 3.1 反义义寡核苷苷酸技术术 反义义核苷苷酸:是一类经 人工合成或构建的反义表达

8、载 体表达 的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过碱 基互补原 理，干扰基因的解旋、复制、转录 、mRNA的剪接加工乃至输出 和翻译等各个环节 ，从而调节细 胞的生长、分化等。 根据结结合部位的不同分为为:反义义DNA（asDNA）、反义义RNA（ asRNA）、自催化性核酶（ribozyme）。 最常用的为反义寡脱氧核苷酸（反义寡核苷酸 ），其优优点在于其理论上的高度靶特异性（碱基互 补）、设计容易、多样且合成简单及高度的局部 性和针对性。 3.2 反义义RNA技术术 反义义RNA技术术:是利用基因重组技术,构建人工表达 载体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶 m

9、RNA形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。 其作用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑 制靶基因的表达。 3.3 核酶技术术 核酶(Ribozyme) 技术术:是一类具催化活性的特殊RNA 分子,通 过碱 基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解与其互补的 mRNA及在DNA内插 入DNA片段构成三链结构 ，单个 核酶分子 可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部位断裂,而其本身具有较 稳定的空间结构 ,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高 。常见的核酶有锤头状 、发夹状 和斧头状 三种,应用最多的是锤 头状 核酶。 反义义技术术的两种两种 技术术路线线: u将

10、将表达与达与 体内内基因或mRNA互补补序列的基因转转入体内内 ，使细细胞表达与达与 目标标基因互补补的mRNA失活，从从而阻 断断目标标基因的表达达； u体外合成mRNA互补补的核苷苷酸类类似物，通过静过静 脉注射 等途径进径进 入细细胞，特异异性的与与目标标mRNA作用。 u反义义寡聚核苷苷酸 与与mRNA特异异性 结结合，阻断断翻译译 过过程。 4.基因敲除和敲入 4.1 基因敲除( Gene knockout ) 又称基因打靶(genetargeting)，是同源重组技术的形象说法，通 过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。它是指用外源DNA 与受体细胞基因组中顺序相同或者非常相近

11、的基因发生同源重组，整 合到受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。 u优优点：此技术整合位点确定、精确，转移基因频率较 高，既可以用正常基因敲除突变的基因，以进行性状 的改良和遗传病的治疗；又可以用突变的基因敲除正 常的基因，以研究此基因在发育和调控方面的作用。 目前利用基因敲除得到转转基因动动物的程序可简简述如下: (1)克隆基因组中某一基因的全部或部分DNA序列, 用插入 、删除、置换、修饰等手段重建DNA序列,使之成为靶载 体； (2)将靶载 体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA与胚胎 干细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载 体的DNA 序列整合到内源基因组中； (3)

12、将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚，将这些囊胚 导入假孕母鼠子宫中，产生的雄性嵌合鼠子代与正常 的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠， 进而分析被剔除基因的功能。 4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强有力手段 ，但对于许多基因来说，简单的失活常导致令人费解 的无改变的表型。最常见的解释是某些其它基因取代 了靶基因的功能，但要在普通基因敲除小鼠中证明这一 点十分困难。基因敲入即通过基因打靶用一种基因替 换另一种基因以确定它们是否具有相同功能。 基因敲入的设计，是一个类似于普通基因敲除法的一 步同源重组过程。不同之处在于，设计打靶载体时需将 靶基因第一个外显子的N-端序列

13、缺失，并将新的替换 基因置于靶基因的调控序列之下，使其能精确地按照靶 基因的调控模式表达。 此方法不仅能用一种基因置换另一种基因，且可以系 统地改变基因的结构，分析其蛋白产物各功能区的作用 。 5.人工染色体的转导转导 转基因技术是进行蛋白功能分析和基因表达调控的 有力手段,但使用小的质粒重组体存在表达水平低、缺乏 组织特异性等缺点,若将大的DNA片段克隆入酵母人工 染色体(YACs)或细菌染色体，可产生较好的表达水平和 组织特异性,并可精确地调节同源重组。 u酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)： 是一类酵母穿梭载体，具有自主复制序列、克隆位点以及

14、可在细 菌和酵母菌中选择 的标记 基因；还具有酵母菌染色体的一些特点。可 以接受100-1000kb的外源DNA片段。 原理：酵母人工染色体就是把酵母染色体上与基因复制和表达有 关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录 功能和复制功 能。 酵母人工染色体DNA转导转导 的方法： 主要有核注射、脂质体介导和酵母原生质体融合等。 优优点： 可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似 于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。 YAC要具备备的主要功能成份 1）着丝丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需 。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复复制

15、序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点 。 构构建YAC需要4个个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件 u与与外源DNA连连接成线线性DNA分子，导导入酵母细细 胞克隆。 6.基因诱诱捕技术术 基因诱捕是通过物理、化学、生物等方法将一个带 有外源基因如抗药基因或报告基因的DNA载体导入到 ES细胞中。外源基因通过捕获到的内源基因表达调控元 件获得表达的同时，使内源的基因功能丧失。通过显微 注射或ES细胞融合技术可以获得特定基因缺失的动物， 用于功能研究. 7. 基因编码产编码产 物相互作用蛋白的 研研究 细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的相互 作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复

16、合物。因此， 确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产 物相互作用的 上下游蛋白质分子，也是研究新基因功能的一个十分重 要的方面。 目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括传统的 基于亲和分析而建立的免疫共沉淀技术术和近年来建立和 广泛应用的酵母双杂双杂 交系统统等。 免疫共沉淀技术术 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研 究蛋白质相互作用的经典方法。 原理： 利用标签标签 抗体与与融合蛋白携带带的标签标签 之间间的高亲亲和力特性纯纯化 和检检出溶液中的靶靶分子。 该该方法的优优点是： 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰，所处环境条 件接近天然状态的，能够反映体内相互作用情况，也可 分离到天然状态的相互作用蛋白复合物，但应注意，有 时免疫共沉淀的蛋白质并非是直接相互作用，而是间接 的相互作用，其灵敏度也相对较低。 酵母双杂双杂 交系统统 酵母双杂 交系统是一种基于转录 重建而建立的研究生物大分子 相互作用的简便而有效的研究方法。 双杂 交技术的基础是在一些转录 因子中发现 的DNA结合结构 与和转录 激活结构 域，一个转录 激活结构 域联合一个DNA结合结 构域有可