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1、实验二十三 牛传染性鼻气管炎的实验室诊断目 的掌握牛传染性鼻气管炎的实验室诊断方法。内容及方法 对本病的诊断结合流行病学和临诊诊断，即可作出初步诊断。为了确诊，尤其在新发病区，必须依靠病毒的分离鉴定或特异的血清学诊断。一、病毒的分离与鉴定 牛传染性鼻气管炎是牛的一种呼吸道传染病，患牛康复后仍长期带毒。隐性感染的公牛，精液中含有病毒。病毒的分离可确诊本病或检验牛体带毒情况。 1材料准备 (1)病料的采取，用灭菌棉拭子伸入鼻道采集其分泌物，放入含青霉素每毫升l 000单 位，链霉素1000gml，pH7.2的Earles液中，也可刮取眼分泌物，处理方法相同；或棉拭子采取脓疱性外阴阴道炎(早期病变)
2、的阴道粘液，处理方法与上述相同；刚死亡的胎儿，立即以无菌采集肺、肾、脾等组织放入每毫升含青霉素1000单位，链霉素1000gmlpH7.2的Earles液中，或取胸水。采集的病料置4冰箱保存，并在24h内送到实验室供病毒分离。 (2)病料的处理 棉拭子样品，先冻融两次，并充分摇动，挤于拭子，将样品经10000rmin离心10min，取上清液作为细胞培养的接种材料。若是组织样品，经玻璃砂研磨碎后， 用Hanks液制成20悬浮液，经10 000rmin离心10min取上清液供病毒分离。胸水直接 经10000rmin离心10min，取上清液供病毒分离。 2病毒的分离 取经处理过的样品0.2ml，接种
3、于已长好单层的犊牛肾或牛睾丸原代或次代细胞培养瓶中，每份样品接种4瓶，置37吸附1h后，倾去接种液，用Hanks液洗3次，最后加入含3犊牛血清(不含IBR抗体)的细胞培养维持液lml，于37培养，逐日观察细胞病变。若按种后第?天仍不出现细胞病变，则收取其培养物接种于新制备的细胞培养上，盲传3代，观察细胞病变。出现细胞病变者，收取培养物供作病毒鉴定。细胞病变的特征是细胞变圆，聚合呈葡萄串状，拉网，最后脱落。 3病毒的鉴定 取上述有细胞病变的培养物，经冻融裂解两次后，以10000rmin离心10min，取上清液作中和试验进行鉴定。其方法，用IBR阳性血清(效价l：32)和阴性血清分别与该分离物等量
4、混合(固定血清、稀释病毒法)，在37作用60min后；接种于细胞培养，按ReedMuench法计算分离物TCID50的终点。若分离物能引起典型的IBR细胞病变，但经细胞中和试验，其阴性血清和阳性血清组的TCID50的对数之差2.5者，则判该分离物为牛传染性鼻气管炎病毒。 二、常量血清中和试验 本试验是用一定量的已知牛传染性鼻气管炎病毒，检查被检血清中的中和抗体。 (一)材料准备 1细胞制备 用原代或次代犊牛肾细胞或牛睾丸细胞，一般不超过5代，按常规胰酶 消化法制备。原代细胞的培养液为10犊牛血清，90的0.5水解乳蛋白Earles氏液，每毫升200单位青霉素，200gml链霉素，用7.5NaH
5、C03调pH至7.0。次代细胞的营 养液为含10犊牛血清，40的Earle氏液(MEM)，50的Earles液，每毫升200单位青霉素，200gml链霉素，用7.5NaHC03调pH至7.0。将细胞分装在扁瓶(15ml装)供继代培养，或小瓶内(1ml装，供中和试验用)培养。细胞中和试验时，应选择生长良好，90以上形成单层的细胞。接种前，细胞先用内含每毫升200单位青霉素，200gm1链霉素，pH7.17.2的Earles液洗12次。 2抗原制备 种毒繁殖是用牛传染性鼻气管炎BaithaNu67弱毒株，接种于原代或次代犊牛肾细胞上培养繁殖，当8090细胞产生典型细胞病变时，收获细胞培养物，冻融2
6、次，经3 000rmin离心10min，取上清液冻结或冻干保存，并测定病毒滴度 (TCID50)，一般不低于10-30.1ml，即为抗原。病毒TCID50的测定法，首先将病毒按10倍 递增稀释即10-110-8。每个滴度病毒稀释液接种4瓶细胞培养瓶，每瓶接毒0.1ml(接 种前将瓶中原营养液弃去)，在37吸附lh，然后加入含3犊牛血清的Earles细胞维持 液0.9ml，37继续培养，每天定时观察两次，按细胞出现病变的情况做好记录，一般需观 察一周。TCID50终点测定按ReedMueneh方法计算。 3标准阳性血清 效价不低于1：32。 4标准阴性血清 不含牛传染性鼻气管炎抗体的健康牛血清。
7、 5血清处理 被检血清，阳性、阴性血清，不经稀释，用前均于56灭能30min。 (二)操作方法 1试验时，将已知病毒滴度的新鲜抗原，用含每毫升200单位青霉素，200gml链霉素的Earles液稀释成100TCID500.1ml工作抗原。例如抗原滴度为TCID5010-60.1ml， 则工作抗原稀释成TCID5010-40.1ml。 2取灭能的被检血清原液0.5ml(用于检疫)或经对倍稀释后各种稀释度的被检血清 0.5ml(测定抗体效价)加入0.5mll00TCID500.1ml工作病毒抗原。 3将抗原一血清混合物充分混匀，置37中和1L，其间轻微振荡数次，作用后取出抗原血清混合物接种于原代或
8、次代细胞瓶中，每份被检血清样品(或每个血清稀释度样 品)接种4瓶，每瓶接种0.2ml，置37吸附1h后，每瓶加入内含3犊牛血清，每毫升200单位青霉素，200gml链霉素，pH7.17.2的Earles维持液0.8ml，置37继续培养， 72h后观察细胞病变。 4对照：试验时应设正常细胞，阴性血清加抗原，阳性血清加抗原对照，操作方法同试验组。被检血清毒性对照，每份血清样品原液0.1ml接种两瓶细胞，吸附1h后加维持液0.9ml。实际使用工作病毒抗原含量测定，将工作病毒抗原做10倍递增稀释至10-2，每个稀释度接种4瓶细胞，每瓶接种0.1ml，吸附1h后，加0.9ml细胞维持液，计算每次试验中每0.1ml中TCID50的实际用量。(三)判定结果 接种后，于72h判定结果。当病毒抗原对照、阴性血清加抗原对照均 出现细胞病变，阳性血清加抗原对照无细胞病变，被检血清对细胞无毒性，对照细胞正常， 抗原实际用量在100300TCID500.1ml范围内时方能判定。其判定标准是未经稀释的被检 血清能使50以上的细胞管不出现细胞病变者判为阳性。复习题与作业如何确诊牛传染性鼻气管炎?
