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1、在大肠杆菌中以纤维素酶为融合蛋白分泌生产抗菌肽 山东大学微生物技术国家重点实验室，济南250100，中华人民共和国 摘要：抗微生物肽（AMP）是小分子，其是各种生物体中先天免疫系统的必要组分。 AMP具有广谱的抗微生物活性。然而，这种肽在大肠杆菌中的规模生产面临许多困难，因为它们尺寸小、对宿主有毒性。在这里，我们描述了一种新的融合策略，在大量重组大肠杆菌中表达大量胞外的抗菌肽。使用来自枯草芽孢杆菌KSM-64的纤维素酶（Cel-CD）的催化结构域作为融合伴侣，证实五种重组抗微生物肽在培养基中的浓度为184mg / L至297mg / L。自由扩散实验表明，释放的抗菌肽bombinin对大肠杆菌
2、和金黄色葡萄球菌都具有抗菌活性。这种策略将适合于生产抗微生物肽和其他毒性蛋白质。 1.前言 抗微生物肽（AMP）是存在于生物天然免疫系统中用来抵抗外来病原体感染的的小分子内源性肽。抗菌肽不仅具有广谱的抗菌活性，而且对真菌，原生动物，病毒和癌细胞具有强烈的杀伤作用。抗菌肽杀死微生物与它们的阳离子电荷和这些肽的结构有关。这些进化上保守的肽通常是带正电荷的，并且具有疏水和亲水侧，使得分子能够溶于水性环境，但也能够进入富含脂质的膜。一旦在目标微生物膜中，肽通过多种机制杀死靶细胞（Boman，1995b）。因此，抗微生物肽广泛应用于医学，农业，水产养殖和食品工业的领域，因为它们的分子量小和热稳定性好。除
3、了由真核来源产生的AMP之外，由细菌产生的核糖体的细菌素也是AMP。 目前，抗菌肽主要是人工合成和是从动物、植物、昆虫、酵母和大肠杆菌表达提取。其中，大肠杆菌是最常用的蛋白质生产宿主，因为它是具有许多可用的表达和调节工具的最佳表征菌株。然而，抗微生物肽在大肠杆菌中的产量很低，因为它们对宿主有毒性和它们对蛋白酶敏感。例如，构建了组蛋白和PurF的截短片段的融合蛋白，以避免蛋白酶水解并降低组蛋白的毒性。通过重组大肠杆菌中组蛋白基因的多聚体设计，组蛋白的串联重复达到12-mer，其导致重组蛋白的高表达水平。弗林蛋白酶切割所表达的多聚组蛋白产生完整的天然的组蛋白。 大肠杆菌表达系统的另一个缺陷是蛋白质
4、在正常培养条件下的分泌能力。抗菌肽在细胞内表达将增加蛋白质纯化过程的复杂性和成本，这不利于抗微生物肽的大规模生产。最近，据报道，来自果蝇的富含脯氨酸的肽，metchnikowin，其与PelB序列融合，能够大量积累在大肠杆菌的周质空间。这种策略大大简化了下游过程，但是为了释放周质蛋白以获得目标抗微生物肽，仍然需要在收集细胞后加入冷的蔗糖溶液与EDTA一起进行处理。我们以前发现来自芽孢杆菌属的纤维素酶（Cel-CD）的催化结构域可以大量分泌到培养基中。在这项研究，我们描述一种新的策略在细胞外生产的抗菌肽。使用来自芽孢杆菌属的纤维素酶的催化结构域。KSM-64作为融合伴侣，我们能够在细胞外大量产生
5、抗微生物肽。细胞外表达的重组抗微生物肽对大肠杆菌的生长几乎没有影响，这意味着抗菌肽的毒性被Cel-CD遮蔽。这些结果表明该系统具有潜在的应用于抗菌肽或其他毒性蛋白质的工业生产。 2.材料与方法 2.1细菌菌株、载体和试剂 大肠杆菌DH5 和大肠杆菌BL21（DE3）分别用于质粒和蛋白质表达。选择质粒pET28a作为表达载体。限制酶，预染色的蛋白标记物购自Fermentas（MBI，Canada）。T4 DNA连接酶购自NEB（Beverly，MA，USA）。PCR聚合酶Primerstar从TaKaRa（日本）订购.Bombinin和其他抗微生物肽的DNA序列由GenScript（USA）合成
6、。本研究中使用的引物列于表1中，并从BGI（中国北京）订购。所有其他化学试剂均为分析纯，可商购。 2.2表达质粒的构建 使用酶解和连接方法构建质粒。用引物对Cel-CD-F（NcoI）和Cel-CD-L10-R（BamHI） 通过PCR扩增含有NcoI和BamHI限制性位点的cel-cd基因（登录号：M84963,1494-2618）。PCR片段和完整的pET28a载体通过NcoI和BamHI在37下酶解30分钟，并使用凝胶提取试剂盒（OMEGA，中国）纯化。连接过程在T4 DNA连接酶的作用下在25下进行30分钟，然后将重组质粒pET28a-Cel-CD-L10转化到大肠杆菌DH5中。Bam
7、HI限制性位点与肠激酶切割识别序列掺入bombinin的5'端。将酶解的片段连接到质粒pET28a-Cel-CD-L10中，以构建含有融合基因的pCel-bombinin质粒。通过DNA测序（BGI）验证阳性转化体。其他四种来自不同来源的抗菌肽也分别与Cel-CD L10融合。编码四种抗微生物肽的codonoptized DNA序列由GenScript合成（表2）。构建了四种重组质粒pCel histatin5，pCel-magainin，pCel-melittin和pCel-天蚕素（表1）。 2.3重组抗微生物肽的表达 将重组大肠杆菌接种到含有25g/ mL卡那霉素的3mL LB培养
8、基中，在37，250rpm下培养12小时，然后按1接种量接种到50mL的新鲜培养基中，并培养直到光密度600nm下达到0.6-0.8。加入终浓度为0.5mM的IPTG用于诱导融合基因表达。在不同时间取样并在6000rpm离心10分钟。通过SDS-PAGE分析上清液和沉淀，并通过考马斯亮蓝染色检测。使用Easy蛋白定量试剂盒（TransGen）测量蛋白质浓度，使用0.22mg / mL牛血清白蛋白（BSA）作为标准样。 2.4重组抗菌肽的纯化 为了纯化重组蛋白，使用蛋白质超滤器（AmiconBioseparations，Millipore NMWL 10,000）并结合使用缓冲液（50mM磷酸钠
9、，pH 8.0; 0.3M氯化钠; 20mM咪唑）在4下收集上清液。然后如上所述用Profinity IMAC Ni-Charged Resin（Bio-Rad）纯化重组蛋白Cel-bombinin。用5列结合缓冲液洗涤柱，并用洗脱缓冲液（50mM磷酸钠，pH 8.0; 0.3M氯化钠; 250mM咪唑）洗脱蛋白质。然后将洗脱的重组蛋白转移到10KD超离心过滤器（Millipore）中，在4下以6000rpm离心30分钟除去高浓度咪唑。 2.5重组抗菌肽的裂解 使用肠激酶裂解全长重组抗微生物肽。用5L肠激酶（4U /L）和100L纯化的6His Celbombinin（0.5mg / mL）在
10、切割缓冲液（20mM Tris，100mM氯化钠，pH8.0）中进行肠激酶酶解反应。在25下反映9小时，并通过Tricine-SDS-PAGE分析产物。 2.6刚果红染色 使用基于琼脂糖板的测定来测定切割的Cel-CD的水解活性。 1（wt / vol）作为底物的羧甲基纤维素（CMC-Na）加入琼脂糖（0.8，wt / vol）平板中。将含有活化肽和Cel-CD的板在37下培养2小时，然后用0.2（wt / vol）刚果红溶液淹没并染色30分钟。然后除去刚果红溶液，用5mL水洗涤平板。最后，应用5mL 0.9NaCl溶液洗脱15分钟，然后将板干燥并拍照。 2.7抗菌活性测定 通过使用革兰氏阴性
11、大肠杆菌TOP10和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌ATCC 6538p的径向扩散法测定抗微生物活性。简单地说，细菌在Luria-Bertani（LB）中在37、250rpm下培养12小时。将100微升接种物与10mL熔化LB琼脂混合，并倒入无菌培养皿中。使熔化琼脂固化30分钟，然后用无菌环刺穿。重组抗菌肽用肠激酶切割，25反应8 h。将50L反应混合物在转移到平板上的孔中37反应12小时，并测量每个孔周围的透明区的直径。将肠激酶裂解缓冲液和未切割的重组抗微生物肽用作阴性对照，合成bombinin用作阳性对照。 表1本研究中使用的引物和质粒。 下划线代表限制性位点。黑色粗体表示L10柔性肽。黑色粗斜体
12、表示肠激酶切割位点 3.结果 3.1胞外bombinin融合系统的设计及其表达 在以前的研究中，我们发现来自芽孢杆菌属的纤维素酶（Cel-CD）的催化结构域KSM-64可以在重组大肠杆菌BL21（DE3）中过表达时大量分泌，并且Cel-CD可以用作细胞外产生重组蛋白的载体。因此，在这项研究中，我们试图通过与Cel-CD融合在重组大肠杆菌中在细胞外产生抗微生物肽。在以前的研究中，我们发现来自芽孢杆菌属的纤维素酶（Cel-CD）的催化结构域 KSM-64可以在重组大肠杆菌BL21（DE3）中过表达时大量分泌，并且Cel-CD可以用作细胞外产生重组蛋白的载体。因此，在这项研究中，我们试图通过与Cel
13、-CD融合在重组大肠杆菌中在细胞外产生抗微生物肽。 最初使用来自Bombinavariegata的Bombinin作为实例来研究该系统的可行性。将bombinin基因的72bp编码区克隆到3' 端的cel-cd基因并导入pET28a / cel，产生pCel-Bombinin。在Cel-CD和bombinin之间，设计肠激酶的蛋白酶作用位点（DDDDK）用于在随后的下游过程中酶促释放抗微生物肽。肠激酶的作用位点在氨基酸序列DDDDK之后，因此不影响以下AMP。在肠激酶消化位点之前加入含有10个氨基酸残基的柔性肽，以避免Cel-CD对肠激酶酶解的影响。 将含有Cel-Bombinin表达
14、载体的重组大肠杆菌BL21（DE3）培养在LB培养基中用于过表达。在IPTG诱导后0,0.5,1,2,4,6,8和16小时的时间间隔取样用于表达过程的分析（图 1）。诱导0.5 h后，使用考马斯染色很容易检测到细胞内的重组蛋白Cel-Bombinin，并且在8小时后细胞内蛋白质积累达到其最大值（图1A和B）。胞外重组蛋白仅在诱导2小时后检测到，并在细胞生长的培养基中逐渐累积。Cel-bombinin的最终细胞外浓度达到297mg / L。细胞外累积的Cel-Bombinin的含量为约90（图1C）。经过Profinity IMAC NiCharged树脂一步纯化，重组蛋白纯度达到95.5（数据
15、未显示）。这些结果表明在重组大肠杆菌中生产细胞外bombinin是可行的。通过延长培养可以获得大量的细胞外重组蛋白。 图1 Cel-bombinin的分泌表达和纯化。M，蛋白质分子量标记; （A）全细胞蛋白质的表达的cel-bombinin的百分比; （B）表达的cel-bombinin的时间过程分析; （C）分泌的cel-bombinin的时间过程分析; 图2 抗菌肽的表达和溶解性分析。M，蛋白质分子量标记;泳道1，蛋白Cel-CD; 泳道2，蛋白Cel-组氨素; 泳道3，蛋白Cel-bombinin; 泳道4，蛋白Cel- magainin; 泳道5，蛋白Cel-蜂毒肽;泳道6，蛋白Cel-天蚕素; 'a'表示可溶性蛋白质，'b'表示不溶性级分。 表2 分泌抗菌肽的来源不同 3.2 Cel-CD作为其他抗微生物肽生产的通用载体 为了进一步研究Cel-CD是否可以用作细胞外产生其他抗微生物肽的融合伴侣，研究了不同来源的另外四种抗微生物肽，包括magainin II，histatin 5，melittin和天蚕素。通过SDS-PAGE分析这些重组蛋白的表达和溶解度（图2） 。所有融合蛋白以高溶解度表达，并 在培养24小时后在培养基中检测到; 然而，表达和分泌水平不同（表2）。重组Cel-histatin5具有最高的表达水平
