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1、分类号： S4 单位代码：10335 密 级： 无 学 号：10516061 博 士 学 位 论 文 博 士 学 位 论 文 中文论文题目中文论文题目: 西湖水及其它环境中洋葱伯克氏菌的多样西湖水及其它环境中洋葱伯克氏菌的多样 性及其致病性研究性及其致病性研究 英文论文题目英文论文题目: The diversity and pathogenicity of Burkholderia cepacia complex isolates in water of West Lake and other environment in China 作者姓名： 方 媛 指导教师： 谢关林 教授 专业名称：
2、植物病理学 所在学院： 农业与生物技术学院 论文提交日期论文提交日期 二零一零年六月二零一零年六月 中国杭州中国杭州 The diversity and pathogenicity of Burkholderia cepacia complex isolates in water of West Lake and other environment in China By Yuan FANG A Dissertation Submitted as Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Doctor with Major
3、 in Plant Pathology In ZHEJIANG UNIVERSITY Supervisor: Professor Guanlin XIE June, 2010 Hangzhou, China 西湖水及其它环境中洋葱伯克氏菌的多样性及其致西湖水及其它环境中洋葱伯克氏菌的多样性及其致 病性研究病性研究 论文作者签名论文作者签名: 方媛 指导教师签名指导教师签名: 谢关林 论文评阅人 1： 隐名评审 评阅人 2： 隐名评审 评阅人 3： 隐名评审 评阅人 4： 隐名评审 评阅人 5： 隐名评审 答辩委员会主席： 宋凤鸣/教授/浙江大学农生学院 委员 1： 刘凤权/教授/南京农业大学植
4、保学院 委员 2： 戚建华/教授/浙江大学药学院 委员 3： 周雪平/教授/浙江大学农生学院 委员 4： 谢关林/教授/浙江大学农生学院 答辩日期： 二零一零年六月五日 The diversity and pathogenicity of Burkholderia cepacia complex isolates in water of West Lake and other environment in China Authors signature: FANG Yuan Supervisor s signature: XIE Guanlin External Reviewers: Conc
5、ealed review Concealed review Concealed review Concealed review Concealed review Examining Committee Chairperson: Prof. SONG Fengming Examining Committee Members: Prof. LIU Fengquan Prof. QI Jianhua Prof. ZHOU Xueping Prof. XIE Guanlin Date of oral defence： June 5, 2010 本学位论文受本学位论文受 国家自然科学基金项目 洋葱新病原
6、细菌 BURKHOLDERIA CENOCEPACIA 的致病 基因及检测技术研究（30871655） 水稻细菌性谷枯病菌检测技术研究（30671397） 洋葱伯克氏菌作为生物农药的风险分析（30370951） 资助资助 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得 浙江大学浙江大学 或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：
7、年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 浙江大学浙江大学 有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和 借阅。本人授权 浙江大学浙江大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编 致谢致谢 本论文是在导师谢关林教授的悉心指导下完成的。论文从选题、实验设计、 论文撰写
8、、 修改和校对无不凝结着导师的心血和智慧。 五年来导师在学习、 生活、 科研等各方面对我关心和教诲，将使我终身难忘。导师渊博的专业知识、严谨的 治学态度、不懈的科研精神以及身上闪烁的谦逊的学者风范时时刻刻影响着我， 这些品德将是我终身学习的榜样。借此机会，谨向我的导师致以崇高的敬意和衷 心的感谢！ 感谢李斌老师兼师兄在实验和论文写作及发表过程中对我的热心帮助， 他以 丰富的专业知识和实践经验为我提供了宝贵的思路和建议；同时，在平时的实验 和日常生活中， 我还得到了张立新博士、 王国芬博士、 罗金燕博士、 罗远婵博士、 楼妙苗、王笑、徐丽慧、朱勃、余山红、邱文、苏婷、王芳、张国庆、刘宝平、 唐乔
9、梅、褚福强、Ibrahim、Soad、Abdul、沈庆汤、孙虎、谢柳、管培刚等同学 的热情帮助和支持。我所取得的每一分收获都包含着他们的智慧和劳动，衷心感 谢他们在五年的学习和生活上对我的关心！ 感谢室友郭逸容、姜玉萍、李苹芳，是她们的关心和帮助陪伴我度过了五年 的生活！ 特别感谢我的父母、妹妹和我的爱人钱江，是他们一直默默支持我，给予我 无微不至的关怀和鼓励，他们是我顺利完成学业的坚强后盾和感情支柱！ 值此论文完成之际，向所有关心、支持和帮助我的老师、同学、亲人和朋友 表示衷心的感谢！ 最后，谨向参加本次论文评阅、答辩的各位专家致以最真诚的感谢！ 方媛 2010 年 5 月 于杭州华家池畔
10、浙江大学博士学位论文 西湖水及其它环境中洋葱伯克氏菌的多样性及其致病性研究 i 目录 摘要 I Abstract.III 第一章 文献综述.1 1 洋葱伯克氏菌在环境中的重要性.1 1.1 环境中的有益细菌1 1.1.1 农业环境中的植物病害生防菌.1 1.1.2 自然环境中的有毒物质降解菌.2 1.1.3 农业生态环境中的植物促生菌.4 1.2 环境中的有害细菌5 1.2.1 农业环境中的植物病原菌.5 1.2.2 医院环境中的人体条件致病菌.5 1.2.3 自然环境中的冰核细菌.6 1.3 对环境中Bcc菌的风险分析6 2 Bcc在环境中的多样性分析7 2.1 Bcc的分类 7 2.2 鉴
11、定方法的研究进展8 2.2.1 传统鉴定方法.8 2.2.2 分子生物学鉴定方法.10 2.3 Bcc在环境中的分布 14 2.3.1 Bcc在医院环境的分布14 2.3.2 Bcc在CF病人体内的分布.14 2.3.3 Bcc在自然环境中的分布15 2.3.4 自然环境是引起医院环境致病菌的“储藏库”问题.16 3 Bcc菌的致病性研究 .17 3.1 毒力因子及毒力基因17 3.2 致病模型17 4 Bcc作为人体条件致病菌的防治18 4.1 临床管理措施18 4.2 Bcc对抗生素的抗性 18 4.3 壳聚糖抗微生物活性的研究进展20 4.3.1 壳聚糖及其特性.20 4.3.2 壳聚糖
12、的抗微生物活性.20 5 本研究的目的意义.21 第二章 西湖水及其他环境中洋葱伯克氏菌群的分离和鉴定.23 1 材料和方法.24 1.1 供试菌株与主要培养基.24 1.2 样本的采集和处理24 1.2.1 西湖水样的采集.24 1.2.2 免培养方法检测西湖水中Bcc的种群多样性.25 1.3 细菌的分离25 1.3.1 西湖水中的Bcc菌分离和纯化25 1.3.2 医院来源Bcc菌的活化和纯培养.25 目录 ii 1.3.3 杏果腐烂病原细菌的分离.26 1.4 Bcc菌的表型鉴定 .27 1.4.1 革兰氏染色.27 1.4.2 好氧性和厌氧性观察.28 1.4.3 氧化酶反应.28
13、1.4.4 麦康凯平板上菌落观察.28 1.4.5 接触酶反应.28 1.4.6 果腐杏病原细菌的BIOLOG测定28 1.4.7 果腐杏病原菌的脂肪酸（FAMEs）测定.29 1.5 Bcc菌的分子鉴定 29 1.5.1 果腐杏病原菌的 16S rRNA序列鉴定.29 1.5.2 recA基因扩增30 2 结果与分析.31 2.1 用非培养方法对西湖水中Bcc菌的检测31 2.2 细菌的分离31 2.3 Bcc菌的表型鉴定 33 2.3.1 表型初步鉴定.33 2.3.2 杏果腐病原的BIOLOG和脂肪酸鉴定33 2.4 Bcc菌的分子鉴定 33 2.4.1 杏果腐病原细菌的 16S rRN
14、A序列分析.33 2.4.2 Bcc菌群的recA基因扩增36 2.5 西湖水中Bcc菌在 12 个月中的变化动态37 3 讨论.37 3.1 利用非培养方法检测西湖水中Bcc种群的优缺点37 3.2 利用选择性培养基从西湖水中分离Bcc菌的可行性38 3.3 Bcc菌群的鉴定及与疑似菌株的区分.39 3.4 Bcc菌的存在与水温的关系.39 3.5 Bcc菌作为杏果的腐烂病原细菌.40 第三章 洋葱伯克氏菌群的种间分析.41 1 材料和方法.42 1.1 供试菌株和主要试剂42 1.2 Bcc菌DNA模板的制备和recA基因的扩增.42 1.3 限制性酶切长度多态性（RFLP）分析 42 1
15、.4 Bcc基因型特异性引物PCR鉴定.42 1.5 Bcc菌recA基因的克隆.43 1.5.1 Bcc菌株recA基因的PCR扩增.43 1.5.2 PCR扩增产物的回收和纯化43 1.5.3 感受态细胞的制备.44 1.5.4 PCR产物的连接44 1.5.5 连接产物的转化.44 1.5.6 重组质粒的筛选.45 1.5.7 重组质粒的鉴定.46 1.6 Bcc菌recA基因的序列分析和聚类分析.46 1.7 多位点序列分型（MLST）分析.47 浙江大学博士学位论文 西湖水及其它环境中洋葱伯克氏菌的多样性及其致病性研究 iii 2 结果与分析.48 2.1 Bcc菌recA基因的RFLP分析48 2.2 Bcc基因型特异性引物PCR扩增.50 2.3 Bcc菌recA基因的克隆.53 2.4 Bcc菌recA基因序列分析.53 2.5 Bcc菌的多位点序列分型（MLST）鉴定55 2.6 西湖水及其他
